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巢式PCR(NEST PCR枝術.

先用一對靶序列的外引物擴增以提高模板量.然后再用一對內引物擴增以得到特異的PCR帶。此為巢式PCR。若用一條外引物作內引物則稱之為半巢式PCR。為減少 巢式PCR的操作步驟可將外引物設計得比內引物長些，且用量較少。同時在第yi次PCR時采用較高的退火溫度而第二次采用較低的退火溫度。這樣在第yi次PCR時，由于較高退火溫度下內引物不能與模板結合,故只有外引物擴增產物，經過若干次循環。待外引物基本消耗盡，無需取出第yi次PCR產物，只需降低退火即可直接進行PCR擴增。這不僅減少操作步驟。同時也降低了交叉污染的機會。這種PCR稱中途進退式PCR( drop-in, drop-out PCR)上述三種方法主要用于少量DNA模板的擴增。

等位基因特異性PCR(Allele- specificPCR. ASPCR技術

ASPCR依賴于引物3”-端的一個堿基錯配,不僅減少多聚酶的延伸效率,而且降低引物-模板復合物的熱穩定性。這樣有點突變的模板進行PCR擴增后檢測不到擴增產物.可用于檢測基因點突變。

單鏈構型多態性PCR(single- strandconformational polymorphism PCR, SSCPPCR)技術

SSCP- PCR是根據形成不同構象的等長DNA單鏈在中性聚丙1烯酰胺凝膠中的電泳遷移率變化來檢測基因變異。在不含變性劑的中性聚丙1烯酰胺凝膠中,單鏈DNA遷移率除與DNA長度有關外,更主要取決于DNA單鏈所形成的空間構象。相同長度的單鏈DNA因其順序不同或單個堿基差異所形成的構象就會不同，PCR產物經變性后進行單鏈DNA凝膠電泳時，每條單鏈處于一定的位置.靶DNA中若發生堿基缺失、插入或單個堿基置換時.就會出現泳動變位。從而提示該片段有基因變異存在。

突變：PCR克1隆的一大優點是能夠通過克1隆將所需突變引入目的基因中，以便進行突變研究。在 定1點突變中，經過設計的PCR引物可將堿基置換、刪除或插入整合到特定序列中。引物定位到已克1隆至質粒中的序列上。隨后，含有引入突變的PCR產物通過自我連接，重新生成環狀質粒，并用于轉化感受態細胞。

測序：PCR是為測序富集模板DNA的一種相對簡單的方法。為保證DNA序列準確性，強烈建議使用高保真PCR來制備測序模板。在 Sanger測序中，PCR擴增片段經純化并用于測序反應。使用常用的測序引物結合位點對PCR引物的 5′末端進行標記，以簡化測序工作流程。

         二代測序 （NGS）中，PCR被廣泛用于構建DNA測序文庫。在NGS文庫制備中，DNA樣品通過PCR反應富集（在起始量有限的情況下）并使用adaptor（以及用于多重檢測的index）標記。除了具有高保真度，DNA聚合酶還應具有zui小的擴增偏好性，從而使測序文庫具有高覆蓋度。

目前的病毒核酸檢測試劑盒，多數采用熒光定量PCR方法，通過檢測熒光信號的累積來確定樣本中是否含有病毒核酸。那么，核酸檢測到底需要經過哪些步驟呢？概括起來，是 取樣、留樣、保存、核酸提取和上機檢測五個步驟。

取樣

采集人體的分泌物。用鼻咽拭子或咽拭子擦拭鼻腔或咽后壁及雙側扁桃體處

留樣

將拭子頭浸入細胞保存液中，折斷尾部后立即旋緊管蓋

保存

將樣本管放入密封袋中保存好，并及時送檢

核酸提取

將樣本送進實驗室進行核酸提取

上機檢測

將提取物進行熒光PCR擴增反應