pcr引物設計常用解決方案「多圖」

ELISA 是一種結合抗原、抗ti特異性反應和酶對底物高xiao催化作用的高敏感性免yi學實驗技術。ELISA 的基礎是抗原或抗ti的固相化及抗原或抗ti的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗ti仍保持其免yi學活性，酶標記的抗原或抗ti既保留其免yi學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本(測定其中的抗ti或抗原)與固相載體表面的抗原或抗ti起反應，洗滌使固相載體上形成的抗原抗ti復合物與液體中的其他物質分開，再加入酶標記的抗原或抗ti，通過反應使其結合在固相載體上。此時固相上的酶含量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。線粒體的組成可以從兩個層面上反映物種及群體的遺傳和進化，即核酸序列組成和基因組的結構特征，兩者的特征具有不同的進化機制和進化速度，在進化生物學研究中可以很好的互補。

甲l基化特異性的PCR

Herman 等（ 1996 ）在使用重亞硫酸鹽處理的基礎上新建的一種方法。該方法敏感性高，主要用于作定性研究。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發生jia基化的胞嘧定被轉化為尿嘧ding，而jia基化的胞嘧定不變；隨后設計針對jia基化和非jia基化序列的引物進行PCR。通過電泳檢測MSP擴增產物，如果用針對處理后jia基化DNA鏈的引物能得到擴增片段，則說明該位點存在jia基化；采用結合微陣列技術在染色體基因表達調控區域檢查染色體活性,是深入分析癌l癥、心血l管病以及中央神經系統紊亂等疾病主要通路的一-種非常有效的工具。反之，說明被檢測的位點不存在jia基化。

特點：適用范圍廣，能夠檢測特異位點是否發生jia基化。

亞硫酸氫鹽測序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

亞硫酸氫鹽修飾后測序法（ BSP ） Frommer 等（ 1992 ）提出的研究 DNA jia基化方法，此方法可靠性及jing確度高，能明確目的片段中每一個 CpG 位點的jia基化狀態。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發生jia基化的胞嘧ding被轉化為尿嘧ding，而jia基化的胞嘧ding不變。隨后設計BSP引物進行PCR，在擴增過程中尿嘧定全部轉化為胸腺嘧定，zui后對PCR產物進行測序就可以判斷CpG位點是否發生jia基化，稱為BSP-直接測序法。將PCR產物克long至載體后進行測序，可以提高測序成功率，這種方法稱為BSP-ke隆測序法。逆轉錄病毒表達系統是一種新的重組蛋白表達系統，由逆轉錄病毒載體、輔助載體（表達病毒包裝需要的蛋白質）和包裝細胞系組成。

特點：jing確度高，能夠準確檢測出jia基化的程度百分比。

分子與質粒載體構建

實驗原理

外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下,有Mg2 、ATP存在的連接緩沖系統中，將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有—種大腸連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。分子實驗介紹——熒光定量PCR檢測熒光定量PCR是檢測生物樣品中RNA含量的普遍的方法，通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。

T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應分為3步：，T4DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶—AMP復合物；然后，酶—AMP復合物再結合到具有5’磷酸基和3’羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；后產生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。

DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法，為了防止載體本身的自連，可以通過(牛堿性磷酸酶)CIP處理克服。

連接反應的溫度在37℃時有利于連接酶的活性.但是在這個溫度下，粘性末端的氫鍵結合是不穩定的。因此人們找到了一個折中溫度，即12-16℃，連接12-16h(過夜)，這樣既可大限度地發揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結構的穩定。