對色譜柱升至一恒定溫度,通常為其溫度上限。特殊情況下,可加熱至高于使用溫度10-20℃左右,但是一定不能超過色譜柱的溫度上限,那樣極易損壞色譜柱。當到達老化溫度后,記錄并觀察基線。初始階段基線應持續上升,在到達老化溫度后5-10分鐘開始下降,并且會持續30-90分鐘。如果在應用中系統所使用的是ECD或NPD等,那么在老化色譜柱時,應該將柱子與檢測器斷開,這樣檢測器可能會更快達到穩定。當到達一個固定的值后就會穩定下來。如果在2-3小時后基線仍無法穩定或在15-20分鐘后仍無明顯的下降趨勢,那么有可能系統裝置有泄漏或者污染。遇到這樣的情況,應立即將柱溫降到 40℃以下,盡快的檢查系統并解決相關的問題。如果還是繼續的老化,不僅對色譜柱有損壞而且始終得不到正常穩定的基線。
制備型加壓液相色譜,按照色譜柱和樣品量的大小,分為:(1)低壓液相色譜;(2)中壓液相色譜;(3)高壓液相色譜;(4)快速色譜。低壓、中壓與高壓液相色譜的壓力范圍之間會存在一定交疊,沒有統一、明確的標準。 快速色譜柱壓通常為2bar(或30psi)左右,對于那些容易分離的簡單混合物,由于快速色譜具有操作簡便、經濟等優點,常常是實驗室的佳選。但快速色譜不同于一般的層析分離,這種分離沒有壓力,而快速分離通常使用瓶裝氮氣加壓,使流動相具有一定的流速,從而縮短了分離時間。 快速色譜使用的柱子一般是玻璃柱,柱直徑為3~10cm.長度為7~15cm。快速色譜中使用廣泛的固定相為硅膠。非極性柱稱為反相柱,反相柱常以水為流動相的主體,再加入不同配比的有機溶1劑做調節劑。采用的粒徑通常為:25~40μm,40~63μm或63~200μm的球形固定相。其它如鍵合相、氧化鋁、聚酰胺吸附劑也常用作快速色譜的固定相使用。
液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相,稱為經典液相色譜法,此方法柱效低、時間長(常有幾個小時)。液相色譜法(High performance Liquid Chromatography,HPLC)是在經典液相色譜法的基礎上,于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發展起來的。有不少文獻報道,對填料可以進行一下處理提高了分離效果,如,對硅膠進行的(或緩沖液)處理。也稱現代液相色譜。
HPLC的特點和優點
HPLC有以下特點:
高壓—壓力可達150~300Kg/cm2。色譜柱每米為75 Kg/cm2以上。
高速—流速為0.1~10.0 ml/min。
—可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。
高靈敏度—紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。