無酶切位點T載體常用指南「友名生物」

基因的分子手術是相當復雜的過程，其中zui重要的是連接酶

互補堿基之間的配對，形成雙鏈。并在DNA連接酶的作用下，使同一DNA分子的兩端連接成環狀，或使兩個分子連成一大的線狀分子。不同限制性內切酶切割DNA產生的三種不同類型的末端。

基因的分子手術是相當復雜的過程，除了需要限制性內切酶外，還需要其他- -些工具酶包括連接酶、DNA 聚合酶、RNA聚合酶、核酸酶、末端修飾酶等，對DNA或RNA進行各種各樣的修飾。其中zui重要的是連接酶。

DNA連接酶的性質

噬菌體T4DNA連接酶分子也是一條多肽鏈，分子量為60Ku，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化過程需要ATP輔助。T4DNA連接酶可連接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和雙鏈DNA粘性末端或平頭末端。另外，NH4C1可以提高在大腸桿1菌DNA連接酶的的催化速率，而對T4DNA連接酶則無效。無論是T4DNA連接酶，還是大腸桿1菌DNA連接酶都不能催化兩條游離的DNA鏈相連接。

DNA copy主要的特點是半保留copy、半不連續copy。在copy過程中，原來雙螺旋的兩條鏈并沒有被破壞，它們分成單獨的鏈，每一條舊鏈作為模板再合成一條新鏈，這樣在新合成的兩個DNA分子中，一條鏈是舊的而另外一條鏈是新的，因此這種copy方式被稱為半保留copy。

DNA的兩條鏈是反向平行的，一條是 5'→3'方向，另一條是 3'→5'方向。在copy起點處，兩條鏈解開形成copy泡(replication bubble ), DNA向兩側copy形成兩個copy叉(replication fork)。隨著DNA的不斷解旋，兩條鏈變成單鏈形式，可以作為模板合成新的互補鏈。但是，生物細胞內所有的DNA聚合酶都只 能催化 5'→3'延伸。因此，以3 '→5'的鏈為模板鏈時，DNA聚合酶可以沿 5'→3'的方向合成互補的新鏈，這條鏈稱為前導鏈(leading strand )。當以另一條鏈為模板時則不能連續合成新鏈，這條鏈稱為滯后鏈(lagging strand )。這時，DNA聚合酶從copy叉的位置開始向遠離copy叉的方向合成1?2 kb的新鏈片段，待copy叉向前移動相應的距離后，又重復這一過程，合成另一個類似大小的新鏈片段，這些片段被稱為岡崎片段(Okazaki fragment)。zui后，由另一種DNA聚合酶和DNA連接酶負責把這些岡崎片段之間的RNA引物除去，并把缺口補平，使岡崎片段連成完整的DNA鏈。這種前導鏈的連續copy和滯后鏈的不連續copy在生物細胞中是普遍存在的，稱為DNA的半不連續copy。

所有合成cDNA條鏈的方法都要用依賴于RNA的DNA聚合酶(反轉錄酶)來催化反應，主要有兩個關鍵因素，一個是mRNA模板，另一個是反轉錄酶 [3]  。商品化反轉錄酶有從禽類成髓細胞瘤病毒純化到的禽類成髓細胞病毒（AMV）逆轉錄酶和從表達化的Moloney鼠病毒反轉錄酶基因的大腸中分離到的鼠病毒（MLV）反轉錄酶。AMV反轉錄酶包括2個具有若干種酶活性的多肽亞基，這些活性包括依賴于RNA的DNA合成，依賴于DNA的DNA合成以及對DNA-RNA雜交體的RNA部分進行內切降解（RNA酶H活性）。MLV反轉錄酶只有單個多肽亞基，兼備依賴于RNA和依賴于DNA的DNA合成活性，但降解DNA—RNA雜交體中的RNA的能力較弱。且其熱穩定性較AMV反轉錄酶差。MLV反轉錄酶能合成較長的eDNA（如大于2～3kb）。AMV反轉錄酶和MI。V反轉錄酶利用RNA模板合成cDNA時的適pH、適鹽濃度和適溫度各不相同．所以合成鏈時相應調整條件是非常重要的。