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污染的監測

一個好的實驗室，要時刻注意污染的監測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。

1、陽性對照：在建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽性對照，它是PCR反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。陽性對照要選擇擴增度中等、重復性好，經各種鑒定是該產物的標本，如以重組質粒為陽性對照，其含量宜低不宜高（100個拷貝以下）。但陽性對照尤其是重組質粒及高濃度陽性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。因而當某一PCR試劑經自己使用穩定，檢驗人員心中有數時，在以后的實驗中可免設陽性對照。

2、陰性對照：每次PCR實驗務必做陰性對照。它包括：

  （1）標本對照：被檢的標本是血1清就用鑒定后的正常血1清作對照；被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照。

  （2）試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進行PCR擴增，以監測試劑是否污染。

3、重復性試驗。

4、選擇不同區域的引物進行PCR擴增。

隨機引物擴增技術(arbitrary primedPCR, AP- PCR)

AP-PCR技術通過隨意設計或選擇一個非特異性引物.在PCR反應體系中.首先在不嚴格條件下使引物與模板中許多序列通過錯配而復性。如果在兩條單鏈上相距一定距離有反向復性引物存在,則可經Taq酶的作用使引物延伸而發生DNA部分片段的擴增。經一至數輪不嚴格條件下的PCR循環后，再于嚴格條件下進行擴增。擴增的產物經DNA測序凝膠電泳分離后.經放1射性自顯影或熒光顯示即可得到DNA指紋圖。AP-PCR用于腫1瘤的抑制基因、癌基因的分離;菌1種、菌株及不同物種的鑒定;遺傳作圖;不同分化程度或某些不同狀態下的組織的基因表達差異等方面的研究。

差示PCR (differential PCR, d -PCR)技術

d-PCR可以定量檢測標本靶基因的拷貝數。它是將目的基因和一個單拷貝的參照基因置于一個試管中進行PCR擴增。電泳分離后呈兩條區帶,比較兩條區帶的豐度，或在引物5°-端標記上放1射性核素后.通過檢測兩條區帶放1射性強度即可測出目的基因的拷貝數。

定量PCR(quantitative PCR, qPCR)技術

qPCR技術是用合成的RNA作為內標來檢測PCR擴增目的mRNA的量,涉及目的mRNA和內標用相同的引物共同擴增.但擴增出不同大小片段的產物.可容易地電泳分離。一種內標可用于定量多種不同目的mRNA。qPCR可用 于研究基因表達。能提供特定DNA基因表達水平的變化.在癌1癥、代謝紊亂及自身免1疫性疾病的診斷和分析中很有價值。

PCR技術不僅可用于基礎研究，還適用于日常的臨床診斷、法醫學調查和農業生物技術研究。這些應用要求可靠的性能、及時的靈敏度和嚴格的標準。因此，所使用的PCR儀和PCR試劑必須符合這些要求和目的。

分子診斷應用包括基因檢測、致癌突變檢測以及感1染性疾病檢測。在法醫學中，利用 PCR進行人類身份鑒定是通過對特別的短串聯重復序列（STR）進行擴增而區分個體的。在農業學中，PCR在食物病原體檢測、育種植物基因分型和 GMO測試中具有重要作用。