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然后加入羊抗人IgM-HRP（辣根過氧化物酶）酶結合物，經第二次孵育后，酶結合物就會與次孵育結合上的HEV IgM相結合，洗板除去未結合的酶結合物，加入TMB底物溶液，在第三次孵育時會發生酶-底物反應，只有那些含有HEV IgM和酶結合物所形成的復合物的孔才會發生顏色變化，加入硫酸溶液終止酶和底物間的反應