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分光光度計(jì)的工作原理

進(jìn)行分光光度測定時，請務(wù)必采取適當(dāng)?shù)念A(yù)防措施，例如戴手套，具體取決于您使用的生物或化學(xué)溶液的類型。

在測量樣品的紫外-可見光譜之前，打開設(shè)備并讓燈和電子元件加熱。

準(zhǔn)備相同溶液的空白樣品，具有相同的pH和相似的離子強(qiáng)度，但沒有分析的組分;由于比色皿和溶劑可以分散光，因此分析該樣品是必要的步驟。

傳統(tǒng)的分光光度計(jì)樣品架設(shè)計(jì)用于容納塑料和石英碗。將原始溶液吸移到碗中。

擦去任何指紋并濺到碗的外側(cè)后，將比色杯正確插入樣品架并關(guān)閉杯蓋門。

永遠(yuǎn)不要忘記關(guān)上門，因?yàn)閺拈_放式分光光度計(jì)發(fā)出的紫外線輻射會損壞眼睛和皮膚。

編程將傳輸?shù)綐悠返乃璨ㄩL或波長范圍。這取決于分析的組分可以吸收的佳波長。然后，通過測量空白樣品使機(jī)器歸零，這將減去由于樣品緩沖液引起的底部吸光度。

根據(jù)您正在進(jìn)行的分光光度實(shí)驗(yàn)的類型，可能需要在樣品測量之前生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，從中可以終確定樣品中分析的化合物濃度。

讓樣品達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟炔⑤p輕混合，以免引入氣泡。然后可以將樣品直接添加到機(jī)器內(nèi)部的碗中，并且可以進(jìn)行讀數(shù)。

對樣品進(jìn)行吸光度測量后，對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行適當(dāng)?shù)挠?jì)算;例如，確定濃度或酶活性水平。

分光光度計(jì)的應(yīng)用

分光光度計(jì)的通常用途之一是測量細(xì)胞密度。細(xì)胞密度測量可用于產(chǎn)生細(xì)菌的對數(shù)生長曲線，從中可以確定重組蛋白整合的佳時間。

分光光度計(jì)還可用于測量化學(xué)反應(yīng)速率。在該實(shí)施例中，吸光度用于監(jiān)測酶促反應(yīng)，通過452nm的中間反應(yīng)隨時間消失。可以通過將數(shù)據(jù)與適當(dāng)?shù)牡仁狡ヅ鋪碛?jì)算該酶促步驟的速率。

微量分光光度計(jì)的引入消除了對樣品架的需求。這些分光光度計(jì)使用表面張力來保持樣品。

微量分光光度計(jì)是測量昂貴的小體積樣品（如生物分子，包括蛋白質(zhì)和核酸）的質(zhì)量和濃度的佳選擇。

蛋白質(zhì)在280nm處的吸光度取決于在色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸中發(fā)現(xiàn)的芳族側(cè)鏈的含量，以及兩個半胱氨酸之間存在的二硫鍵。

蛋白質(zhì)的濃度可以由其在280nm處的吸光度和其吸收系數(shù)確定，該吸收系數(shù)基于氨基酸的組成。

DNA和RNA在260nm處具有大吸光度，從中可以確定它們的濃度。還可以從吸光度讀數(shù)與特定波長的比率來評估核酸的純度。

常見分光光度計(jì)分類

(1)可見分光光度計(jì)

用來測量待測物質(zhì)對可見光(400～760nm)的吸光度并進(jìn)行定量分析的儀器，稱為可見分光光度計(jì)。可在600nm測定細(xì)菌細(xì)胞密度。

(2)紫外可見分光光度計(jì)

紫外可見光譜儀用來測量待測物質(zhì)對可見光或紫外光(200～760nm)的吸光度并進(jìn)行定量分析的儀器。可以測定核酸和蛋白的濃度，也可以測定細(xì)菌細(xì)胞密度，紫外分光光度計(jì)又可分為單光束,假雙光束,雙光束。它們的用途又有區(qū)別。