pcr實驗室自噬凋亡檢測「在線咨詢」

ELISA 是一種結合抗原、抗ti特異性反應和酶對底物高xiao催化作用的高敏感性免yi學實驗技術。microRNA芯片:RNA干擾(RNAInterference,RNAi)現象是一種進化上保守的抵御轉基因或外來病毒qin犯的防御機制。ELISA 的基礎是抗原或抗ti的固相化及抗原或抗ti的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗ti仍保持其免yi學活性，酶標記的抗原或抗ti既保留其免yi學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本(測定其中的抗ti或抗原)與固相載體表面的抗原或抗ti起反應，洗滌使固相載體上形成的抗原抗ti復合物與液體中的其他物質分開，再加入酶標記的抗原或抗ti，通過反應使其結合在固相載體上。此時固相上的酶含量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。

DNA測序檢測

1. PCR測序反應

(1)取0.2ml的PCR管，用記號筆編號，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑:

所加試劑測定模板管標準對照管

BigDye Mix

1μl

待測的質粒DNA

1μ 1

pGEM-3Zf ( )雙鏈DNA

-1μ1

待測DNA的正向引物

M13(-21)引物- 1μ 1

滅菌去離子水

2μ 1

總反應體積5μ 1,不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。

(2)將PCR管置于9600或2400型PCR儀.上進行擴增。98C變性2min后進行PCR循環，

PCR循環參數為96C 10s， 50C 5s， 60°C4min， 25 個循環，擴增結束后設置4C保溫。

2.乙醇法純化PCR產物

(1) 將混合物離心，將擴增產物轉移到1.5ml EP管中。

(2)加入25μ 1/乙醇混合液，充分振蕩，置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于

4C離心30 min,小心棄上清。

(3)加70%(V/V)的乙醇50μ 1 洗滌沉淀2次。12 000r/min 于4C離心5min,小心棄上清和

管壁的液珠，真空干燥沉淀10~ 15min。

3.電泳前測序PCR產物的處理。

(1)加入12μ 1的TSR于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉淀，稍離心。

(2)將溶液轉移至蓋體分離的0.2ml PCR管中，稍離心。

(3)在PCR儀上進行熱變性(95C 2min),冰中驟冷，待_上機。

4..上機操作按儀器操作說明書安裝毛細管，進行毛細管位置的校正，人工手動灌膠和建立

運行的測序順序文件。

5.儀器將自動進行序列分析，并可根據用戶要求進行序列比較。如測序序列已知，可通過

序列比較以星號標出差異堿基處，提高工作效率。

6.測序完畢按儀器操作規程進行儀器清洗與保養。

RNA提取

1.棄去培養液，用PBS清洗兩次1-2。

2.棄去PBS，用1000u1槍吸干凈殘余PBS。

3.加1ml TRIZOL研磨B 41。

4. 1.5mIEP管標號與每孔相對應備用。

5.研磨好的溶液轉移至對應的 EP管中國。

6.往每個EP管中加入250ul，劇烈震蕩30s， 冰上靜置12min[問l。

7. 所有樣品4C離心，轉速: 13500轉1分鐘，時間: 15min.

8. 再次標記一批同樣編號EP管。

9.離心后吸上清液400u1移入相應編號的EP管中，再加入400ul異充

分混勻。4C冰箱35min。

10. 4C離心，轉速: 13500轉1分鐘，時間: 10min.

11.棄去.上清液，加1m175%乙醇，輕搖7]。

12. 4C離心，10600轉/分鐘，時間: 5min.

13. 棄上清液濾紙吸干。

14. 加DEPC水10ul溶解，-80C保存。進行逆轉錄前測濃度。

組織RNA提取

1、剪米粒大小組織塊放入EP管中標號。

2、EP管中加300ul trizol浸泡30分鐘或更久。

3、用研磨棒研磨，以肉眼很難看到組織為宜。

4、加700u1 trizol靜 置5分鐘。

STR檢測

短串聯重復(Short tandem repeats, STR)，又稱微wei星DNA(Microsatellite DNA)或簡單重復序列(Simple repeat sequence, SRS或SSR)，是廣泛存在于原核生物和真核生物基因組中的核苷酸重復序列。報告:根據證實為大腸陽性的管數，查MPN表，報告每100ml(g)大腸菌群的MPN值。有絲分裂過程中DNA鏈之間的錯配引起的fu制滑動被認為是導致STR產生的較為常見原因，并且依據不同fu制單元大小的不同以及不同物種之間，fu制滑動發生的概率也不相同。

STR是以核心序列 (core repeat units) 首尾相連多次重復形成。化學鍵合固定相，根據鍵合的基團不同可用于反相或正相色譜，其中常用的是十八烷基硅l烷(又稱ODS)鍵合硅膠，可用于反相色譜或離子對色譜離子交換填料，用于離子交換色譜，是有一定孔徑的大孔填料，用于排阻色譜。每個STR的核心序列結構相同，長度為2-6bp，但其重復單位數目和重復區域的長度不同，因此STR在不同種族、不同人群之間的分布具有差異性，構成了STR遺傳多態性。不同個體之間在一個同源STR位點的重復次數也不同，因而同指紋識別一樣，STR位點分析也可對個體進行身份識別。通過識別個體基因組在特定位點的特定序列重復，即可創建其基因檔案?；诖耍琒TR分析法已經成為一種重要的鑒定分析方法，應用于法醫學、qin子鑒定及細胞鑒定等領域。