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發布時間:2020-12-28 09:19  





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1、FAA固定液固定的樣品。取材要求:固定液預冷,取材冰上操作。材料大小8 mm×5 mm×3 mm左右。取材后抽真空5~20 min。該步驟重復至材料沉入玻璃瓶底部, 使樣品充分固定后,4 ℃過夜。
2、需要研究的基因信息。
(簡稱原位雜交,in situ hybridization histochemistry;ISHH)屬于分子雜交的一種,是一種應用標記探針與組織細胞中的待測核酸雜交,再應用標記物相關的檢測系統,在核酸原有的位置將其顯示出來的一種檢測技術。熒光原位雜交技術是一種重要的非性原位雜交技術,原理是利用報告分子(如生物素、等)標記核酸探針,然后將探針與染色體或DNA纖維切片上的靶DNA雜交,若兩者同源互補,即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。原位雜交的本質就是在一定的溫度和離子濃度下,使具有特異序列的單鏈探針通過堿基互補規則與組織細胞內待測的核酸復性結合而使得組織細胞中的特異性核酸得到定位,并通過探針上所標記的檢測系統將其在核酸的原有位置上顯示出來。
良好的前期標本制備十分重要,這點對于采用秋水仙素刺激得到中期染色體分裂象尤為重要。刺激時間過短或過長都會影響實驗觀察,因此需要耐心摸索作用時間。
蛋白酶K的作用濃度。濃度高了極易影響細胞核形態,造成模糊不清,濃度低了則探針不易進入細胞核,雜交率大大降低。石蠟切片一般要達到10-30min,不要超過半小時,一般來說,20g/L蛋白酶K在50℃下消化20min足矣。
探針標記。市售的探針盒子花樣繁多,盡量選擇大品牌的試劑盒。嚴格按照其操作步驟和條件進行。不同廠家的盒子中使用的酶存在差異,因此這一步操作需要根據實際情況操作。
雜交液滴到組織上后不要太用力掀開蓋玻片,而是在漂洗的時候采用滴管在其側面滴洗,輕輕沖下蓋玻片。這一步是很有必要的!而在封片時,一定要密封好玻片,可以采用凝膠類的物質封住四周。