榆林流式細胞檢測承諾守信 南京英瀚斯

 細胞ELISPOT檢測    

     1．培養板的預處理：在24孔培養板內加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，棄掉板中的處理液，用PBS洗滌3次，每次3min；

     2．抗原包被：將適量抗原溶于包被緩沖液中，每孔加入0.5ml，4℃過夜，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     3．制備細胞懸液：將待測已致敏小鼠處死，取出pi臟，置于加有Hanks液的平皿內，用鈍頭直角9號zhu射器針頭破少許脾被膜后，趕出細胞，用毛細吸管輕輕吹散細胞團后，將懸液通過250目尼龍網，取濾液，1000r/min離心5min，Hanks液洗滌3次，計數細胞后，用1640液重新懸浮細胞，配成所需濃度；管底的細胞團不要打散，沿管壁倒入適量(一般為材料體積的5-10倍)的2。

     4．往各孔中加入0.5ml含不同濃度（104-106/ml）的細胞懸液，置37℃，5％CO2條件下孵育2-4h，棄掉培養液，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃過夜，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     6．加入辣根過氧化物酶結合的親合素（Avi-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     7．配制明膠-底物液：在37℃水浴中，將2.5mlTMB溶液（4mg/ml  jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明膠溶液（用pH5.0磷酸鈉-檸檬酸緩沖液配制）邊加邊攪，溶液呈白色，加入14μl 3% H202；

     8．顯色與計數：將培養板底冰浴，每孔加入0.6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計數所顯示出的顏色的斑點。

細胞檢測服務

作為生物體結構和功能的基本單位，細胞在機體的各項新陳代謝的生命活動中發揮著重要的作用，與此同時，細胞的生理過程，在一定程度上也是機體生命活動的反應。因此利用多種精密儀器，結合特異性的檢測試劑，對體外培養的細胞直接檢測其增殖的基本過程，或對細胞進行不同的處理后檢測細胞生活周期內各項指標的變化，從而深入揭示細胞新陳代謝的具體機制。細胞實驗介紹——流式細胞術檢測細胞周期和凋亡流式細胞術檢測細胞周期：細胞周期：指細胞從前一次分裂結束起到下一次分裂結束為止的活動過程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期組成。

BrdU染色原理

 BrdU (5-脫氧尿核苷)是胸腺的衍生物，常用于標記中新合成的DNA,可代替胸腺選擇性整合到細胞中新合成的DNA中(細胞周期S期)。這種摻入可以穩定存在，隨著DNA進入子細胞中BrdU特異性可以用于檢測BrdU的摻入，從而判斷細胞的增殖能力。BrdU特異性可以用于檢測BrdU的摻入，從而判斷細胞的增殖能力。集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和調亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現象。

注射或細胞培養后利用抗Brdu單，ICC染色，顯示增殖細胞。同時結合其它細胞標記物，雙重染色，可判斷增殖細胞的種類，增殖速度，對研究細胞動力學有重要意義。因組織細胞內無內源性Brdu存在，所以Brdu應用較廣摻入雙鏈DNA內的Brdu,以氫鏈與腺呤結合，不能直接與抗Brdu反應，需經解鏈使Brdu暴露方能被染色。常用的解鏈方法為鹽酸加熱、蛋白酶處理等，使DNA雙鏈部分單鏈化，抗Brdu小鼠單與增殖細胞核內的Brdu結合，再經酶標抗小鼠IgG孵育、



呈色，顯示進入S期細胞的情況。小鼠成骨細胞和破骨細胞共培養模型的建立細胞之間的相互調控作用奠定基礎。

2、快速脂質體轉染法操作步驟如下 [方法二]：

(1) 以 5×105 細胞/孔接種 6 孔板 (或 35 mm 培養皿) 培養 24 小時，使其達到 50～60% 板底面積。

(2) 在試管中配制 DNA/脂質體復合物方法如下：

①在 1 mL 無 DMEM 中稀釋 PSV2-neo 質粒 DNA 或供體 DNA。

②旋轉 1 秒鐘，再加入脂質體懸液，旋轉。

③室溫下放置 5～10 分鐘，使 DNA 結合在脂質體上。

(3) 棄去細胞中的舊液，用 1 mL 無 DMEM 洗細胞一次后棄去，向每孔中直接加入 1 mL DNA/脂質體復合物，37℃ 培養 3～5 小時。

(4) 再于每孔中加入 20?S 的 DMEM，繼續培養 14～24 小時，

(5) 吸出 DMEM/DNA/脂質體混合物加入新鮮 10?S 的 DMEM，2 mL/孔，再培養 24～48 小時。

(6) 用細胞刮或消化法收集細胞，以備分析鑒定。

3、穩定的脂質體轉染方法如下：

(1) 接種細胞同前，細胞長至 50% 板底面積可用于轉染。

(2)DNA/脂質體復合物制備轉染細胞同前 (2)、(3) 步驟。

(3) 在每孔中加入 1 mL、20?S 的 DMEM，37℃ 培養 48 小時。

(4) 吸出 DMEM，用 G418 選擇培養液稀釋細胞，使細胞生長一定時間，篩選轉染，方法參照細胞篩選法進行。