重組人Rab5B 蛋白值得信賴 紐斯特生物技術(shù)

武漢紐斯特生物科技有限公司（WuhanNewEastBiotechonologyCo.Ltd），系美國(guó)生命科學(xué)試劑供應(yīng)商美國(guó)NewEastBio在中國(guó)的子公司。公司位于武漢東湖高新技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)光谷生物城.美國(guó)NewEastBio專注于生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，主要產(chǎn)品有小分子、ELISA試劑盒、蛋白等，與世界高校和研究所、世界大制藥公司、生物科技公司和醫(yī)院等客戶建立了長(zhǎng)期穩(wěn)定的合作關(guān)系，產(chǎn)品銷往全球。

懸浮細(xì)胞

1.培養(yǎng)細(xì)胞并根據(jù)需要用活化劑或抑制l劑刺激。

2.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后通過(guò)離心沉淀細(xì)胞。

3.吸出培養(yǎng)基，并用冰冷的PBS洗滌兩次。

4.完全除去PBS洗滌液，然后向細(xì)胞沉淀物中加入冰冷的1X分析/裂解緩沖液（每1 x 107個(gè)細(xì)胞0.5 – 1 mL）。

5.通過(guò)重復(fù)移液裂解細(xì)胞。

小G蛋白是從屬于細(xì)胞調(diào)節(jié)因子中的一個(gè)超家族。Rho家族是小G蛋白中的一個(gè)亞家族，它在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂以及基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮主要作用。而本試劑盒中的Cdc42就屬于Rho亞家族中的一種， Cdc42參與生理活動(dòng)過(guò)程中其分子結(jié)構(gòu)會(huì)呈現(xiàn)出2種相互轉(zhuǎn)換的形式：與GTP結(jié)合的激l活狀態(tài)和與GDP結(jié)合的非活性狀態(tài)。

目前Cdc42蛋白活性的檢測(cè)主要是依據(jù)小GTP酶Cdc42可以與p21活化激酶（PAK）的p21結(jié)合區(qū)域（PBD）結(jié)合，使PAK活化從而發(fā)揮生物學(xué)功能，進(jìn)而間接的進(jìn)行Cdc42活性l功能的監(jiān)測(cè)。然而此方法在檢測(cè)過(guò)程中存在著一定的局限性比如GTP水解成GDP的速度過(guò)快以及Cdc42-GTP結(jié)合蛋白與p21結(jié)合區(qū)域之間較低的親和力，導(dǎo)致這種檢測(cè)方法的重復(fù)性較差。

試劑盒成分

特異性識(shí)別Cdc42活性構(gòu)象的鼠單克l隆抗l體（Anti-active Cdc42, Mouse MonoclonalAntibody (Catalog No. 26905)）：小管裝--30ul (抗l體濃度是1mg/ml)，抗l體溶于PBS（pH7.4）并包含50%的甘油和0.05%的疊氮l化鈉。此抗l體可以特異性識(shí)別所有脊椎動(dòng)物中的Cdc42-GTP。

Protein A/G agarose (Catalog No. 30301) ：小管裝—400ul包含200ul Protein A/G agarose     和200ul 20%乙醇溶液。（使用時(shí)溶液需要充分混勻，再吸取）

5X Assay/Lysis Buffer (Catalog No. 30303)：小瓶裝—30mL包含250 mM Tris-HCl (pH 8.0),     750 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 5 mM EDTA, 5% Triton X-100。

特異性識(shí)別Cdc42活性構(gòu)象的兔多克l隆抗l體（Anti-Cdc42, Rabbit Polyclonal Antibody  (Catalog No.21010)）：小管裝--30ul (抗l體濃度是1mg/ml)，抗l體溶于PBS（pH 7.4）并包含有   50%的甘油。

100 X GTPγS (Catalog No. 30302) ：小管裝—100ul (10 mM) ，實(shí)驗(yàn)中0.5mL細(xì)胞裂解液使用      5ul GTPγS標(biāo)記。

100 X GDP (Catalog No. 30304) ：小管裝—100ul (100 mM) ，實(shí)驗(yàn)中0.5mL細(xì)胞裂解液使用5ul GDP標(biāo)記。

儲(chǔ)存條件

試劑盒的成分在試劑盒的有效期限內(nèi)必須存放于4°C條件下保存。

試劑（試劑盒內(nèi)不提供，由實(shí)驗(yàn)者自行配置）

1.  刺激和未刺激的細(xì)胞裂解物；

2.  蛋白酶抑制l劑；

3.  4 °C 搖桿或者搖床；

4.  0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5.  1 M MgCl2；

6.  2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7.  電泳和免l疫印跡相關(guān)試劑；

8.  免l疫印跡緩沖液TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05%

Tween-20)；

9.  免l疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA)；

10. PVDF或硝l酸纖維素膜；

11.  二抗；

12.  ECL 檢測(cè)試劑；