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T4 RNA Ligase主要用于RNA和RNA之間的連接，連接時需要5'磷酸基團和3'羥基的存在。不僅可以進行RNA分子間的連接，也可以進行RNA分子(zui短8個堿基)的環化連接。

T4 RNA Ligase可以用于RNA和單核苷酸之間的連接，單核苷酸必須為5'和3'均磷酸化的形式，此時常用于RNA的3'末端標記。

T4 RNA Ligase也可以用于DNA和RNA之間的連接。當DNA提供5'磷酸基團，RNA提供3'羥基時，連接效率較高；當DNA提供3'羥基，RNA提供5'磷酸基團時，連接效率非常低。

T4 RNA Ligase也可以用于DNA和DNA之間的連接，但連接效率非常低。主要用于DNA的環化連接，例如5' RACE中的cDNA環化。DNA和DNA之間的連接盡管可以進行，但比較困難。

cDNA是指具有與某RNA鏈呈互補堿基序列的DNA。與RNA鏈互補的單鏈DNA，以其RNA為模板，在適當引物的存在下，由依賴RNA的DNA聚合酶（反轉錄酶）作用而合成，并且在合成單鏈cDNA后，再用堿處理除去與其對應的RNA以后，以單鏈cDNA為模板，由依賴DNA的DNA聚合酶或依賴RNA的DNA聚合酶作用合成雙鏈cDNA。在這種情況下，mRNA的cDNA，與原來的基因組DNA相同而且無內含子；相反地，對應于在原來基因中沒有的而在mRNA存在的3'末端的poly A序列等的核苷序列上，與外顯子序列、先導序列以及后續序列等一起反映出mRNA結構。
置換合成法。該方法利用鏈在反轉錄酶作用下產生的DNA RNA雜交鏈不用堿變性，而是在dNTP存在下。利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切口和缺口。從而產生一系列RNA引物，使之成為合成第二鏈的引物。在大腸DNA聚合酶工的作用下合成第二鏈。該反應有3個主要優點：①非常有效；②直接利用鏈反應產物，無須進一步處理和純化；③不必使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA中的單鏈發夾環。