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Elisa試劑盒——Elisa實驗常見問題及解決方案

顯色淡，靈敏度偏低

1  試劑盒未充分平衡 試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開盒蓋，于室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫（約25℃）

2  樣品不適合做ELISA檢測 樣品一般選擇培養上清、血漿。其他樣品形式可能不適合做ELISA檢測或者需要優化檢測的條件（例如稀釋液的成分）

3  酶標板在貯存或洗后拍干時過分干燥 防止板過于干燥

4  包被遭到破壞 操作溫和，移液槍不能碰到孔底

5  樣本和孵育條件不合適 按照說明書條件，建議孵育過程中全程振蕩孵育。

6  洗滌浸泡時間過長 按照說明書操作。勿人為增加浸泡時間；

7  偶聯HRP試劑污染 棄去試劑，重新配置

8  錯誤的稀釋偶聯HRP試劑 棄去試劑，重新配置

9  TMB底物孵育時間過短，因非人為因素影響，需要優化孵育時間 確定合適的孵育時間：人為判定-高濃度的標準品出現深藍色；S4-5有淡藍色；機器判定620 nm波長下測定OD值達到0.6-0.65

10  樣本濃度過高或存在基質效應 建議做不同稀釋倍數，確認樣本稀釋倍數。

11  濾光片設置有問題或者波長選擇不對 確認儀器設置及選擇正確的波長檢測。

12  酶標板不適合做ELISA 不能使用細胞培養板，建議使用ELISA高吸附力板子。

不正常的標準曲線

1  錯誤的方法重懸標準品  加入正確量的溶液重懸標準品，重懸充分

2  標準品稀釋錯誤  按照說明書要求稀釋標準品

3  標準品污染  使用一次性的滅菌吸頭， 標準品貯存于2-8 ℃

4  錯誤的倍比稀釋步驟  按照說明書倍比稀釋標準品

5  波長選擇錯誤 TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用，而 前者比色波長為450nm，后者為492nm。雙波長比色分析優于單波長。

6  標準品混用  不同批號試劑勿混用

7  試劑盒在運輸途中時間太長，溫度太高，標準品失活  盡量縮短運輸時間，夏季應放冰塊降溫

8  ELISA未終止而直接檢測450nm和620nm TMB顯色需終止后檢測，否則會出現620nm比450nm讀數高的現象。（數值仍有梯度規律）

ELISA試劑盒-ELISA檢測原理介紹

酶聯吸附試驗（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）指將可溶性的抗原或結合到聚乙烯等固相載體上，利用抗原結合專一性進行反應的定性和定量檢測方法。它是應用比較多的一種酶技術。ELISA試劑盒（ELISAKits）已成為藥品和植物病理學研究中的常用診斷工具，是檢測組織提取液和細胞培養液中目標/抗原的理想工具，也是重要的質量控制手段。