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發布時間：2021-06-14 05:05
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大鼠shen小球內皮細胞分離培養
2.原代細胞培養:(1)shen臟原位灌洗:SD大鼠用25%烏拉坦腹整注射麻zui后仰臥固定。胸腹部消森并分離胸主動脈,以無菌的冷Hank液漱朱洗血.同時剪破shen靜脈利于液體流出。1-2min后shen臟色澤變白,取出雙shen冰浴保存。脂質體瞬時轉染1、細胞H9C2(Hela)6孔板Hela1x10°/孔。
(2)shen小球分離:參照Green等方法改進。將灌洗后的shen臟撕下shen被膜.去除髓質后將皮質剪成約1-2mm'的碎塊，輕碾shen皮質依次通過80.120和200目鋼篩。收集shen小球。
(3)shen小球消化和培養；調亡I期(pro-apoptosisnuclei)的細胞核內染色質高度盤繞，出現許多稱為氣穴現象(cavitati)的空泡結構。將提取的shen小球加人0.1% IN 型膠原酶消化后收集沉淀。以2x10* 的shen小球數接種于鋪有1%明膠培養瓶內,加A配制好的內皮細胞培養液(MFM.Hepes 20 mmnoVL 20%胎牛xue清0. 66 U胰島素/ml.血管內皮生長因子20 ng /ml、肝素鈉100 u/ml.青莓su100 U/ml、鏈霉su100 μ/ml) .靜止培養3 d后逐日觀察shen小球的貼壁情況。待shen小球充分貼壁后常規換液.第3同進行純化。
三、自噬過程進行觀察和檢測
1、觀察自噬體的形成
由于自噬體屬于亞細胞結構，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特征為:新月狀或杯狀，雙層或多層膜,有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體(AV1 )的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結構，內含胞漿成分，如線粒體、內質網、核糖體等。自噬溶酶體(AV2 )的特征為:單層膜，胞漿成分己降解。電鏡形態學觀察法是一種比較經典、可靠的方法，被認為是確定細胞凋亡的金標準。( autophagic vacuolo AV )
2、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋 白來示蹤自噬形成由于電鏡耗時長，不利于監測(Monitoring) 自噬形成，人們利用LC3在自噬形成過程中發生聚集的現象開發出了此技術。無自噬時，GFP-LC3融合蛋 白彌散在胞漿中;自噬形成時，GFP-LC3融合蛋白轉 位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當于一個自噬體，可以通過計數來評價自噬活性的高低。其檢測原理為活xi胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。
3、利用Western Blot檢測LC3-II/比值的變化以評價自噬形成自噬形成時，胞漿型LC3 (即 LC3-I)會酶解掉一小段多肽，轉變為(自噬體)膜型(即LC3-ID，因此，LC3-II/比值 的大小可估計自噬水平的高低。(注意: LC3對LC3-II有更高的親和力，會造成假陽性。方法2和3需結合使用，同時需考慮溶酶體活性的影響。將上層細胞懸液倒入一個裝有10mlMEF生長培養基的50ml離心管中，用200目的尼龍網過濾后，以1500rpm離心5分鐘收集細胞，再用30mlMEF生長培養基洗滌兩次。)
4、MDC (Monodansylcadaverine ，單丹磺酰尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的。
5、CellTrackerTM Green染色:主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特異性的。
細胞分化
細胞分化是指同一來源的細胞逐漸產生出形態結構、功能特征各不相同的細胞類群的過程，其結果是在空間上細胞產生差異，在時間上同一細胞與其從前的狀態有所不同。細胞分化的本質是基因組在時間和空間上的選擇性表達，通過不同基因表達的開啟或關閉，終產生標志性蛋白質。細胞誘導是指將一群不同類型或者形態結構、功能特征存在差異的細胞通過生物學、物理學等手段，將之轉變為具有相似/相同形態結構、功能特征的細胞群體的過程。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)來區分凋亡和壞死細胞。
