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細胞實驗介紹——流式細胞術檢測細胞周期和凋亡

流式細胞術檢測細胞周期：

細胞周期：指細胞從前一次分裂結束起到下一次分裂結束為止的活動過程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期組成。G0/G1期：有絲分裂發(fā)生，細胞分裂成兩個細胞，進入下一個細胞周期，或者進入靜止期（G0期），而G0期從DNA含量上無法與G1期區(qū)分，細胞開始RNA和蛋白質的合成，但DNA含量仍保持二倍體。(5)把消化所得的軟gu細胞混懸液收集于離心管中，經濾網(wǎng)過濾后用細胞計數(shù)板計數(shù),并把細胞混懸液密度調整為2x105/ml接種于25cm2規(guī)格的培養(yǎng)瓶中。S期：DNA開始合成，細胞核內DNA的含量介于G1期和G2期之間。G2期和M期：當DNA成為4倍體時，細胞進入G2期。G2期細胞繼續(xù)合成RNA及蛋白質，直到進入M期。

PI法是經典的周期檢測方法。結果:約24小時組織塊邊緣有游離的新生細胞長出,7天即融合成片。PI為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結合，其結合的量與DNA的含量成正比例關系，用流式細胞儀進行分析，就可以得到細胞周期各個階段的DNA分布狀態(tài)，從而計算出各個期的百分含量。

一般流程：細胞收集-70%酒精固定過夜-PI染色-流式細胞儀檢測。

細胞凋亡：細胞凋亡的早期就有細胞膜表面破損發(fā)生。破損時凋亡細胞表面的磷脂腺絲氨酸(PS)可以從細胞內膜翻轉至細胞的外膜。(6)用含15%胎牛xue清及青鏈mei素的DMEM/F12以106/mL的細胞濃度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置37°C、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。該過程發(fā)生在之前，檢測PS的表達，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2 依賴的磷脂結合蛋白，對PS有很高的親和性，并且可以與暴露于細胞外的PS相結合。利用這一原理，可以將AnnexinV標記熒光來識別早期的細胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)來區(qū)分凋亡和壞死細胞。PI的膜通透性很差，因而只能標記壞死的細胞。

一般流程：細胞收集-PI-AnnexinV標記-流式細胞儀檢測。

結果示例：

                                   圖 A 細胞周期檢測圖；B 細胞凋亡檢測圖

細胞實驗介紹——細胞運動能力檢測：

細胞劃痕實驗是體外模擬細胞遷移能力和修復能力快捷的檢測方法。在長滿的細胞培養(yǎng)板或者培養(yǎng)皿中，沿著中線使用移液器槍頭或者其他硬物劃1-3條平行的直線，去除中線的細胞，細胞在0h、12h、24h后，觀察細胞往中線遷移情況，判斷細胞遷移能力。

一般流程：細胞接種培養(yǎng)-劃痕-不同時間點拍照

細胞遷移和侵襲實驗是體外模擬細胞遷移和侵襲能力的檢測方法。使用不同孔徑的聚碳酸酯膜transwell小室放入培養(yǎng)板中，將細胞接種于小室中，利用培養(yǎng)液成分的差異誘導細胞運動，檢測細胞的遷移和侵襲能力的差異。

一般流程：transwell小室準備-細胞接種-細胞培養(yǎng)-transwell小室染色-顯微鏡拍照

                                       圖 A 細胞劃痕實驗圖；B，C 細胞遷移和侵襲實驗圖

 細胞ELISPOT檢測    

     1．培養(yǎng)板的預處理：在24孔培養(yǎng)板內加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，棄掉板中的處理液，用PBS洗滌3次，每次3min；

     2．抗原包被：將適量抗原溶于包被緩沖液中，每孔加入0.5ml，4℃過夜，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     3．制備細胞懸液：將待測已致敏小鼠處死，取出pi臟，置于加有Hanks液的平皿內，用鈍頭直角9號zhu射器針頭破少許脾被膜后，趕出細胞，用毛細吸管輕輕吹散細胞團后，將懸液通過250目尼龍網(wǎng)，取濾液，1000r/min離心5min，Hanks液洗滌3次，計數(shù)細胞后，用1640液重新懸浮細胞，配成所需濃度；細胞接種：收到客戶細胞后，我們會用細胞計數(shù)板計數(shù)細胞，得出細胞懸液濃度。

     4．往各孔中加入0.5ml含不同濃度（104-106/ml）的細胞懸液，置37℃，5％CO2條件下孵育2-4h，棄掉培養(yǎng)液，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃過夜，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     6．加入辣根過氧化物酶結合的親合素（Avi-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     7．配制明膠-底物液：在37℃水浴中，將2.5mlTMB溶液（4mg/ml  jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明膠溶液（用pH5.0磷酸鈉-檸檬酸緩沖液配制）邊加邊攪，溶液呈白色，加入14μl 3% H202；

     8．顯色與計數(shù)：將培養(yǎng)板底冰浴，每孔加入0.6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養(yǎng)板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計數(shù)所顯示出的顏色的斑點。

流式細胞分選

流式細胞分選技術是利用流式細胞分選儀，以高能量激光照射高速流動狀態(tài)下被熒光色素染色的單細胞或微粒,測量其產生的散射光和發(fā)射熒光的強度,從而對細胞(或微粒)的物理、生理、生化、免yi、遺傳、分子生物學性狀及功能狀態(tài)等進行定性或定量檢測的--種現(xiàn)代細胞分析技術，它可根據(jù)發(fā)射光的熒光強度和波長將發(fā)光顆粒亞群分開并可實現(xiàn)單ke隆分選，能復雜樣本中的細胞進行鑒定、分類、定量和分離,單次可同時對其中一種到四種特定細胞進行超高速分選純化、高通量單分選或細胞芯片制備。CD117(c-kit)陽性細胞和二者都陽性細胞所占百分比前后比較差異無顯著性(P>。分選后的細胞能直接用于培養(yǎng)、移植、核酸提取、單細胞PCR擴增或原位雜交等，可進一步進行細胞基因、蛋白、功能水平的研究和不同細胞之間的差異化研究。硬件中樣本細胞丟棄的比例低于5%，保證樣本中目標細胞的高回收率。