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發(fā)布時間：2021-09-30 01:29
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外顯子測序
外顯子組測序（exome-seq）是對定向富集的基因組DNA進(jìn)行高通量測序，它能夠以相對低的費(fèi)用對人類外顯子組進(jìn)行拷問。2009年，外顯子組捕獲工具的出現(xiàn)，讓外顯子組測序這種技術(shù)迅速紅起來。到目前為止，已有超過1萬個外顯子組被測序。
如今有多家公司推出了外顯子組捕獲試劑，包括羅氏NimbleGen、安捷倫、Illumina，還有現(xiàn)在的華大基因。這些方法究竟孰優(yōu)孰劣，斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)系的研究人員對市場上三個主流的外顯子組測序平臺進(jìn)行了比較。該研究結(jié)果發(fā)表在《Nature Biotechnology》上。研究人員利用安捷倫、Illumina和NimbleGen的外顯子組測序平臺對同一個人類血液樣品進(jìn)行分析。他們的結(jié) 果表明，NimbleGen平臺作為一個使用高密度重疊探針的平臺，盡管覆蓋了較少的基因組區(qū)域，但在靈敏檢測小的變異時所需的測序量也少。在同樣獲得80M測序數(shù)據(jù)的情況下，NimbleGen有97%的目標(biāo)序列達(dá)到10x以上的測序深度，而其他產(chǎn)品只有90%。二、大腸菌群檢驗(yàn)方法:由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，即:需氧及兼性厭氧、在37°C能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞。而安捷倫和Illumina的探針能夠在低密度下捕獲更多數(shù)量的變異。此外，Illumina還捕獲了未翻譯的區(qū)域，這是NimbleGen和安捷倫平臺無法靶定的。研究人員還比較了同一樣品的外顯子組測序和全基因組測序（WGS），顯示外顯子組測序能夠檢測到WGS錯過的小變異。
除了文中提到了三個主流平臺，外顯子組捕獲方面的新產(chǎn)品也在不斷推出，研究人員的選擇也將更廣泛。羅氏NimbleGen即將推出新一代的外顯子液相捕獲產(chǎn)品。高l效液相色譜法適用于能在特定填充劑的色譜柱上進(jìn)行分離的藥品的分析測定，特別是多組分藥品的測定、雜質(zhì)檢查和大分子物質(zhì)的測定。這一新產(chǎn)品將可捕獲64M的基因組序列，包括外顯子以及miRNA，它含與其他NimbleGen液相捕獲產(chǎn)品相同的2.1M高密度探針，以高xiao、均一、特異、的定向捕獲。
分子生物學(xué)檢測服務(wù)
隨著生命科學(xué)和化學(xué)的不斷發(fā)展，人們對生物體的認(rèn)知已經(jīng)逐漸深入到微觀水平。從單個的生物體到qi官到組織到細(xì)胞，再從細(xì)胞結(jié)構(gòu)到核酸和蛋白的分子水平，人們意識到可以通過檢測分子水平的線性結(jié)構(gòu)（如核酸序列），來橫向比較不同物種，同物種不同個體，同個體不同細(xì)胞或不同生理（病理）狀態(tài)的差異。這就為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域提供了技術(shù)平臺。逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建及包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retrovirus）是一類RNA病毒。分子生物學(xué)檢測技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)與分子遺傳學(xué)取得進(jìn)步的結(jié)晶，是在人們對基因的結(jié)構(gòu)以及基因的表達(dá)和調(diào)控等生命本質(zhì)問題的認(rèn)識日益加深的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的。近年來，分子生物學(xué)檢測技術(shù)的方法學(xué)研究取得了進(jìn)展，先后建立了各種分子生物學(xué)檢測技術(shù)。
通常活性氧陽性對照在刺激細(xì)胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
收集細(xì)胞后裝載探針：按照1：1000用無培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10微摩爾/升。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為一百萬至二千萬/毫升，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。具體操作參見SN0169-92《中華人民共和國進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸檢驗(yàn)方法》。直接用活性氧陽性對照及自己感興趣的刺激細(xì)胞，或把細(xì)胞等分成若干份后刺激細(xì)胞。通常活性氧陽性對照在刺激細(xì)胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
2.、檢測
對于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)、熒光或流式細(xì)胞儀檢測。
對于收集細(xì)胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計(jì)、熒光或流式細(xì)胞儀檢測，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察也可以。
18.引物是經(jīng)過PAGE純化的，為什么還有堿基缺失或插入？
答：理論上分析型PAGE變性電泳，可以區(qū)分引物之間一個堿基的差別。但是制備PAGE電泳，上樣量都是非常大，電泳時的條帶非常寬，帶與帶之間有重疊，分辨率已下降，電泳后割帶回收目的引物時，很難說不割到差別僅幾個堿基的引物。國內(nèi)有一個不好的現(xiàn)象，PAGE純化的引物，特別是長引物要的量都比較高，導(dǎo)致割的條帶有時可能比較寬。蛋白質(zhì)上樣濃度不要超過10mg/mL,否則會造成蛋白質(zhì)的聚集或沉淀。建議：您如果減少OD數(shù)，引物遇到的問題可能就會少一些。
19. TaqMan 探針設(shè)計(jì)的基本原則是什么？
答：下列原則供您參考。
◆TaqMan 探針位置盡可能靠近擴(kuò)增引物（擴(kuò)增產(chǎn)物50-150bp），但不能與引物重疊。
◆長度一般為18-40mer 。
◆G-C含量控制在40-80%左右。
◆避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)。
◆在引物的5'端避免使用G。
◆選用比較多的堿基C。
◆退火溫度Tm控制在 68-70C 左右。
有用的熒光染料參數(shù)
