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              發布時間:2021-08-31 22:06  

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              核酸試劑盒

              核酸檢測試劑盒為什么會出現漏檢?

              大家在新聞上看到過核酸檢測出現漏檢的現象,這是為什么呢?首先,我們對病毒認識不足,疾病進展目前都不清楚,這就可能導致采樣時間不合適,從而漏檢。第二,每個人的抵抗力不同,同樣都有了病毒,但有的人能快速地清除病毒,體內病毒量少,自然不易檢出。第三,試劑盒有自身的靈敏度限制,也就是說樣本中的病毒量少到一定程度,試劑盒是檢測不出來的,這是核酸檢測技術上的限制,另外,樣本采集是否規范、轉運保存是否恰當等因素都會影響試劑盒的陽性檢出率。



              RPA技術主要依賴于三種酶:能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性,反應溫度在37°C左右。

              重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA復合物,能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列,就會發生鏈交換反應形成并啟動DNA合成,對模板上的目標區域進行指數式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結合,防止進一步替換。在這個體系中,由兩個相對的引物起始一個合成事件。整個過程進行得非常快,一般可在十分鐘之內獲得可檢出水平的擴增產物。RPA擴增的基礎體系(TwistAmp? Basic)含有DNA擴增所需的所有試劑,我們只要準備好引物和模板就行。擴增結果可以通過凝膠電泳進行終點檢測,產物純化后可用于下游研究。

              在這個基礎體系中添入不同的酶和探針,就可以實現多樣化的RPA應用。舉例來說,TwistAmp? exo結合了exo探針技術和核酸外切酶III,能實現數據的實時讀取,就像熒光定量PCR一樣。不過反應終點的擴增子總量有所減少,適合獲得強熒光信號進行動力學分析,不適合終點檢測(比如跑膠)。將exo探針技術、核酸外切酶III和逆轉錄酶結合起來,可以一步實現RNA模板的實時擴增。




              等溫核酸試劑盒

              目前,核酸檢測方法主要包括PCR法、恒溫擴增法、測序法、CRISPR檢測法等。其中,第二代PCR技術是病毒檢測方法的主流方法,也是目前認可的SARS-CoV-2測定方法。第二代PCR技術,又稱熒光PCR法,是指在反應體系中加入了熒光物質,通過專門儀器實現實時熒光檢測,并對模板進行定量計算。為了增加靈敏度和特異性,熒光PCR法出現了不少改進版本,包括Taqman探針法、雙重或多重熒光PCR等。




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