感受態細胞動物實驗模型「英瀚斯」

細胞實驗介紹——慢病毒建立穩轉細胞系

慢病毒包裝：公司使用3質粒慢病毒包裝系統，慢病毒系統使用pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G，過表達慢病毒系統使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三質粒系統，將質粒混勻后使用磷酸鈣轉染方法轉染至HEK293T細胞中，培養48h后，收集上清。使用genecopo公司慢病毒顆粒純化試劑盒將慢病毒純化。純化后留取部分檢測病毒滴度，其余病毒凍存于-80℃冰箱中。磁性細胞標記方式應用MACS技術進行磁性細胞分選重要的一點是高質量的標記。

滴度檢測：將病毒顆粒使用梯度稀釋，分別293T細胞，72h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達情況。根據細胞熒光量計算病毒滴度。

細胞：在病毒前一天對細胞進行計數，接種約10000個細胞于12孔板中，培養過夜后使用無培養基稀釋病毒，加入12孔板中對細胞進行，病毒數量根據推薦細胞的MOI加入（若無推薦MOI，需做病毒梯度：1,5,10,50,100 5個梯度對細胞），6h后去除含病毒溶液，加入完全培養基細胞培養，培養48h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光強度。同時加入puromycin對細胞篩選，篩選約2周時間。細胞篩選好后，使用定量PCR和Western blot檢測目的基因的穩定表達情況。4、脂質體5ul補培養基至50ul混勻靜止5分鐘(質粒與脂質體比例為1:2或1。

實驗流程：慢病毒質粒構建-HEK293T細胞培養-質粒轉染293T細胞-病毒收集-病毒純化-病毒滴度檢測-細胞-穩轉細胞篩選-穩轉細胞鑒定

結果示例：

                                               圖 A 病毒滴度檢測；B 目的細胞病毒效果圖

細胞分化

細胞分化是指同一來源的細胞逐漸產生出形態結構、功能特征各不相同的細胞類群的過程，其結果是在空間上細胞產生差異，在時間上同一細胞與其從前的狀態有所不同。2)陽性CD117(c-kit)陰性特點用流式細胞儀將精原gan細胞分選出來,并在體外進行培養嘗試。細胞分化的本質是基因組在時間和空間上的選擇性表達，通過不同基因表達的開啟或關閉，終產生標志性蛋白質。細胞誘導是指將一群不同類型或者形態結構、功能特征存在差異的細胞通過生物學、物理學等手段，將之轉變為具有相似/相同形態結構、功能特征的細胞群體的過程。

平板克l隆形成實驗基本步驟::

1、取對數生長期的各組細胞，分別用0.25%胰 蛋白酶消化并吹打成單個細胞，并把細胞懸浮在10%胎牛的DMEM培養液中備用。

2、將細胞懸液作梯度倍數稀釋，每組細胞分別以每皿50、100、200 個細胞的梯度密度分別接種含10mL 37預溫培養液的皿中，并輕輕轉動，使細胞分散均勻。置37團5% CO2及飽和濕度的細胞培養箱中培養2~3周。

3、經常觀察，當培養皿中出現肉眼可見的時，終止培養。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細胞5mL固定15分鐘。然后去固定液，加適量GIMSA應用染色液染10~30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

4、將平皿倒置并疊加一張帶網格的透明膠片，用肉眼直接計數，或在顯微鏡(低倍鏡)計數大于10個細胞的數。后計算形成率。結果:30%percoll密度梯度離心前CD117(c-kit)陽性細胞占13。形成率= (數/接種細胞數) x100%平板形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞一定要分散得好，不能有細胞團，接種密度不能過大。平板形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞- -定要分散得好，不能有細胞團，接種密度不能過大。

細胞培養中常見的污染及解決方法

霉菌污染

正常情況下，培養基在 37℃ 培養箱中培養兩三天，在倒置顯微鏡下仍保持透明，無雜質。一旦出現絮狀雜質，顯微鏡下可見絲狀和團塊狀漂浮物，菌絲明顯。此時，雖然細胞仍在生長，但它們的生命狀態會在長時間后逐漸惡化。

解決方法：用硫酸銅溶液擦拭 CO2 培養箱，向托盤中加入飽和硫酸銅或消毒后加入飽和磷酸氫二鈉高鹽溶液，避免霉菌污染。

如果霉菌污染，暫時轉移所有細胞，并立即徹底使用 guo 氧擦拭培養箱，包括層板和內壁。2019年公司成為江蘇省生物技術協會第七屆理事會的特邀理事，成立了“李冬冬創新工作室”，并獲得了南京市“工人先鋒號”的榮譽稱號。將 guo 氧放在培養箱中一小時，使蒸汽擴散，待 guo 氧氣味消散后，將細胞轉移到培養箱中。值得注意的是，培養箱需要每兩個月定期清洗一次，尤其是在梅雨季節。用 84 消毒液、清水和 75% 酒精連續擦拭培養箱，用紫外線照射也是一種有效的方法。

為防止霉菌污染，需添加 3μg/ml 、抑制素、fang

線菌素 D 或青鏈。這是由于zhongt瘤細胞自身可分泌多種生長因子，誘導血管生成。一旦被污染，就不可能恢復，即使使用上述，也沒有什么區別。對于支原體污染的細胞培養，選擇是丟棄污染的培養物，并用使用新鮮的無支原體的儲存液，徹底消毒環境。如果所有的細胞都被污染了，那可能是整個培養系統污染了。因此，必須對培養基和實驗設備進行檢查。如果只是個別污染，可能是操作問題，有必要注意實驗操作步驟的規范。