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發布時間:2021-03-24 07:41  
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1. VASP通過調節Rab11依賴性TGF-β受體的質膜靶向來促進肝星狀細胞的TGF-β活化
肝l病學第61卷,首1期,第361-374頁,2015年1月
2. Rab5活性調節GLUT4分類為胰島素反應性和非胰島素反應性內體室:胰島素抵抗發展的潛在機制。
內分l泌學。 2014年9月; 155(9):3315-28
將裂解液轉移到適當大小的試管中,并置于冰上。
如果發生核裂解,則細胞裂解液可能變得非常粘稠,難以移液。 如果發生這種情況,可將裂解液通過27?號注射l器針頭3-4次以剪切基因組DNA。
通過離心10分鐘(在4°C下為12,000 x g)清除裂解物。
收集上清液并將樣品保存在冰上以備立即使用,或速凍并保存在-70°C以便將來使用。
陽性對照和陰性對照的體外GTPγS/ GDP蛋白質上樣量
注意:體內細胞刺激將激l活可用Arf 6的大約10%,而體外GTPγS蛋白負載將激l活Arf 6的將近90%。
1,將0.5 ml每種細胞提取物等分到兩個微量離心管中(或使用1 μg純化的Arf 6蛋白)。
2,向每個試管中加入20 μl 0.5 M EDTA(終濃度為20 mM)。
3,將5 μl 100 XGTPγS(至100 μM,終濃度)加到一個試管中(陽性對照)。
4,在第二個試管中加入5 μl 100 X GDP(至1 mM,終濃度)(陰性對照)。
5,在攪拌下將試管在30°C孵育30分鐘。
6,通過將試管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2(至60 mM,終濃度)來停止加載。
免l疫印跡和檢測(所有步驟均在室溫下攪拌)
1.在電印跡步驟之后,將PVDF膜浸入100%甲l醇中15秒鐘,然后使其在室溫下干燥5分鐘。注意:如果使用硝l酸纖維素代替PVDF,則應跳過此步驟。
2.在室溫下不斷攪拌下,在TBST中用5%脫脂奶粉或3%BSA封閉膜1小時。
將膜與抗Arf 6兔多克l隆抗l體在5%脫脂奶粉或3%BSA / TBST中以1:50?1000(取決于樣品中Arf 6蛋白質的量)新鮮稀釋,孵育1-在室溫下持續攪拌2小時或過夜4oC。
3.用TBST將印跡的膜清洗3次,每次5分鐘。
4.將膜與二抗(例如山羊抗兔IgG,HRP偶聯物)一起孵育,在室溫下以恒定的比例在5%脫脂奶粉或3%BSA / TBST中以1:1000的比例新鮮稀釋。攪動。
5.用TBST將印跡的膜清洗3次,每次5分鐘。
6.使用您選擇的檢測方法,例如ECL。