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發布時間:2021-10-13 02:52  
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科學家在培養轉0基因植物時,常用什么中的質粒作為載體?
(1)具有較小的分子量。經驗表明,為了避免在DNA的純化過程中發生鏈的斷裂,克1隆載體的分子大小建議不要超過10Kb。pBR質粒這種小分子量的特點,不僅易于自身DNA的純化,而且可容納較大的外源DNA部分片段;
(2)具有兩種抗1菌素抗性基因可供作轉化子的選擇記號,能指示載體或重組DNA分子是否進入宿主細胞以及外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。標記基因往往可以賦予宿主細胞一種新的表型,這種轉化細胞可明顯地區別于非轉化細胞。當我們把一個DNA部分片段插入到某一個標記基因內時,該基因就失去了相應的功能。當把這種重組DNA分子轉到宿主細胞后,該基因原來賦予的表型也就消失了。要是仍保留了原來表型的轉化細胞,細胞內含有的DNA分子一定不是重組子。很顯然,既要指示外源DNA是否進入了宿主細胞,又要指示載體DNA分子中是否插入了外源DNA部分片段,那么這種載體必須至少具有兩個標記基因。另外,pBR質粒載體還具較高的拷貝數,而且經過氯霉1素擴增之后,每個細胞中可積累1000~3000個拷貝,這就為重組體DNA的制備提供了極大的方便。
腺病毒的基因組
腺病毒的基因組以線性的雙鏈DNA形式存在,由蛋白VII和一種稱為mu的小蛋白緊密地環繞在其周圍,起到類組蛋白樣的作用。另一種蛋白V將這種DNA-蛋白復合物連接起來,并通過蛋白VI與病毒衣殼連接在一起。在兩條鏈的5′端各以共價鍵結合著一個被稱為DNA末端蛋白(pTP)復合物(DNA-TPC)的特化的結構,與腺病毒copy密切相關。腺病毒基因組的兩端各有一段100bp的反向末端重復序列(ITR),是copy的起始位點。在左端ITR的3′側有一段長約300bp的包裝信號(ψ)介導腺病毒基因組包裝入病毒衣殼。對腺病毒而言,只有包括兩端的ITR和包裝信號(ψ)的約0.5kb的序列是順式作用元件,也就是說必須由腺病毒載體自身攜帶,而其他的30余種蛋白都可以通過輔助病毒(或細胞)反式補足。
基因導入細胞常用方法
轉染
重組的噬菌體DNA也可象質粒DNA的方式進入宿主菌,即宿主菌先經過CaCl2,電穿孔等處理成感受態細菌再接受DNA,進入感受態細菌的噬菌體DNA可以同樣copy和繁殖,這種方式稱為轉染(transfection)。M13噬菌體DNA導入大腸桿1菌就常用轉染的方法。重組DNA進入宿主細胞也常用轉染方式。zui經典的是1973年建立的磷酸鈣法,其利用的基本現象是:DNA如以磷酸鈣-DNA共沉淀物形式出現時,培養細胞攝取DNA的效率會顯著提高。用電穿孔法處理培養的哺乳類細胞也能提高細胞攝取DNA能力,但所用外加電場的強度、電脈沖的長度等條件與處理細菌者都很不相同。用人工脂質膜包裹DNA,形成的脂質體可以通過與細胞膜融合而將DNA導入細胞,方法簡單而有效,但缺點是有細胞毒性和血1清的不親和性,近年來人們發現了一種更為有效的轉染試劑-陽離子聚合物,其克服了脂質體轉染試劑細胞毒性大,在體內易被血1清清除等缺點,具有轉染效率1高,操作簡單而日益受到重視。