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發布時間：2021-05-10 04:30
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miRNA測序
microRNA(miRNA)是一種大小約21—23個堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發夾結構的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（雙鏈）但是和siRNA密切相關。microRNA通過和靶基因mRNA堿基配對引導沉默復合體（RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，從而在轉錄后水平調控蛋白表達（新發現miRNA也能在轉錄水平調控基因表達）。miRNA在物種進化中相當保守，在動物、植物和真菌等中發現的miRNA表達均有嚴格的組織特異性和時序性。miRNA在細胞生長和發育過程中起多種作用，包括調控發育、分化、凋亡和增殖等。用1ml70%乙醇洗滌沉淀物1次，離心12000rpm，5min。
目前研究miRNA的方法主要是realtime-PCR、生物芯片技術以及第二代測序技術。基于第二代測序技術的miRNA測序，可以一次獲得數百萬條miRNA序列，能夠快速鑒定出不同組織、不同發育階段、不同疾病狀態下已知和未知的miRNA及其表達差異，為研究miRNA對細胞進程的作用及其生物學影響提供了有力工具。結束反應,PCR產物放置于4°C待電泳檢測或-20°C長期保存。
二、大腸菌群檢驗方法:
由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，即:需氧及兼性厭氧、在37°C能分解乳糖產酸產氣的革蘭氏陰性無芽胞。因此大腸菌群的檢測一般都是按照它的定義進行。 目前國內采用的進出口食品大腸菌群檢測方法主要有國家標準和原國家商檢局制訂的行業標準。兩個標準方法在檢測程序上略有不同。標準的生物信息學分析能夠得到mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA各自的研究內容，靶向調控網絡、ceRNA網絡、共表達網絡分析可以將這幾種RNA聯合起來分析，從而發現新的調控網絡模型。
(一)國家標準:國家標準采用三步法，即:乳糖發酵試驗、分離培養和證實試驗。乳糖發酵試驗:樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發酵管。36士1C培養48土2h，觀察是否產氣。分離培養:將產氣發酵管培養物轉種于伊紅美藍瓊脂平板上，36士1°C培養18-24h，觀察菌落形態。證實試驗:挑取平板上的菌落，進行革蘭氏染色觀察。腺病毒包裝原理介紹腺病毒是一種沒有包膜的直徑為79-90nm的顆粒，由252個殼粒呈二十面體排列構成。同時接種乳糖發酵管36士1°C培養24土2h,觀察產氣情況。
報告:
根據證實為大腸陽性的管數，查MPN表，報告每100ml ( g)大腸菌群的MPN值。具體操作參見GB4789. 3-94 《中華人民共和國國家標準食品衛生微生物學檢驗大腸菌群測定》
(二)原國家商檢局制訂的行業標準，等效采用美國FDA的標準方法，用于對出口食品中的大腸進行檢測。本方法采用兩步法：推測試驗:樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管LST肉湯。36士1C培養48士2h，觀察是否產氣。證實試驗:將產氣管培養物接種煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯管中，36士1°C培養48士2h，觀察是否產氣。以BGLB產氣為陽性。分子實驗介紹——熒光檢測細胞熒光染色是以熒光物質標記而進行抗原定位的技術。查MPN表，報告每ml(g)樣品中大腸菌群的MPN值。具體操作參見SN0169-92《中華人民共和國進出口商品檢驗行業標準 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸檢驗方法》
EMSA實驗
EMSA:凝膠遷移或電泳遷移率檢測是一種檢測蛋白質和DNA序列相結合的技術，初用于研究DNA結合蛋白和其相關的DNA結合序列相互作用，可用于定性和定量分析。分為2種類型：同位素標記探針，非同位素標記探針。
通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚bing烯凝膠電泳上，分離復合物和非結合的探針。DNA-復合物或RNA-復合物比非結合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當檢測如轉錄調控因子一類的DNA結合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細胞抽提液。在檢測RNA結合蛋白時，依據目的RNA結合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結合序列的DNA或RN片duan和gua核苷酸片段（特異），和其它非相關的片段（非特異），來確定DNA或RNA結合蛋白的特異性。隨后設計BSP引物進行PCR，在擴增過程中尿嘧定全部轉化為胸腺嘧定，zui后對PCR產物進行測序就可以判斷CpG位點是否發生jia基化，稱為BSP-直接測序法。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據復合物的特點和強度來確定特異結合。
