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發布時間：2021-08-25 02:48
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從動物組織中提取基因組DNA
使用研缽進行勻漿時：
① 取1～100 mg的動物組織或人組織移入冰浴預冷的研缽中，快速用力展研成勻漿。注）下列組織請加液氮研磨至粉末狀。
A．富含DNA酶的胰臟、脾1臟、胸腺、淋巴等組織。
B．富含膠原蛋白的皮膚、肌腱等組織。
C．富含角質蛋白的組織或堅硬的組織（如骨骼）等。
② 加入650 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1，溫和研磨30秒鐘。注）使用上述①-注）的實驗材料時，請在加入Solution A及RNase A1后，將研缽置于65℃水浴上研磨1分鐘。
③ 收集650 μl研磨好的組織勻漿液移至Collection Tube中。如果勻漿體積不足650 μl，請補充Solution A至650 μl，65℃保溫5分鐘。
使用研磨棒進行勻漿時:
① 取1～100 mg的動物組織或人組織移入冰浴預冷的Collection Tube 中，用研磨棒快速研磨成糊狀。
② 加入350 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1后用研磨棒快速研磨成勻漿。
③ 加入350 μl的Solution A將研磨棒上的勻漿沖入Collection Tube中，充分振蕩混合后，65℃保溫5分鐘。
植物ＤＮＡ的ＣＴＡＢ提取法：
1 稱取新鮮葉片2-3ｇ,剪碎放入研缽中,在液氮中研磨成粉末。
2 將粉末轉移到的加有7ｍｌ經預熱的1 5×ＣＴＡＢ提取緩沖液15ｍｌ離心管中,迅速混勻后置于65℃水浴中,溫育30ｍｉｎ。
3 取出離心管,冷卻至室溫,加入氯1仿/異戊1醇(24:1),充分混勻,室溫下2300×ｇ離心20ｍｉｎ。
4 將上清轉移至另一新的15ｍｌ離心管中,加入1/10體積10%的ＣＴＡＢ和等體積的氯1仿/異戊1醇。充分混勻,2300×ｇ離心20ｍｉｎ。
5 轉移上清至另一新的15ｍｌ離心管中,加入等體積1%的ＣＴＡＢ沉淀緩沖液,輕輕搖晃至形成ＤＮＡ絮狀沉淀。1000×ｇ離心10ｍｉｎ,使ＤＮＡ沉淀于管底。
6 加入1 5-2ｍｌ的1ｍｏｌ/ＬＮａＣｌ及5μｌＲＮａｓｅ置于56℃水浴中過夜。待ＤＮＡ完全溶解后,加2-3ｍｌ4℃預冷的95%的冰乙醇使ＤＮＡ沉淀,挑出ＤＮＡ,置于1 5ｍｌ離心管中,用70%乙醇清洗30ｍｉｎ,用離心機甩5ｓ,倒出70%乙醇,再用95%乙醇浸泡5ｍｉｎ,倒出95%乙醇,在超凈工作臺上吹干。
7 將風干的ＤＮＡ直接在4℃保存備用或溶于100μｌＴＥ溶液中于-20℃保存。
適用于ＰＣＲ研究的快速提取法：
1 田間剪取植株新鮮葉片5-10ｍｇ(約2ｃｍ長)左右,新鮮葉片放于1 5ｍｌ離心管中,存于冰盒中,根據樣品號貼上相應的標簽。
2 用剪刀將葉片組織剪細(約0 5ｃｍ長)放在點穴式研板中。
3 加入400μｌＤＮＡ提取緩沖液,用玻棒將葉組織研細,直到液體變成深綠色即可。
4 再加400μｌＤＮＡ提取緩沖液,混合均勻,轉入一新的1 5ｍｌ離心管(貼上相應的編號)。
5 加400μｌ氯1仿,混合均勻后,2400×ｇ離心30ｓ,將上清液轉入一支新的1 5ｍｌ離心管(貼上相應的編號)。
6 加800μｌ無水乙醇,混勻,2400×ｇ離心3ｍｉｎ。棄上清。
7 70%乙醇沖洗,風干。
8 用50μｌＴＥ緩沖液溶解,存于-20℃。
9 取1μｌ用于ＰＣＲ分析。
