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發布時間：2021-06-13 04:58
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MTT檢測
MTT 是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活xi胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 MTT 還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二jia基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免yi檢測儀在 570nm 波長處測定其光吸收值，可間接反映活xi胞數量。(3)從中間剪斷股骨和脛骨，用2ml無菌注she器吸取DMEM/F12溶液沖出gu髓細胞多次，再用針頭吹打，吸管吸入離心管內，1000r/min離心5min，棄上清，用PBS重懸細胞。
細胞ELISPOT檢測
1．培養板的預處理：在24孔培養板內加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，棄掉板中的處理液，用PBS洗滌3次，每次3min；
2．抗原包被：將適量抗原溶于包被緩沖液中，每孔加入0.5ml，4℃過夜，PBS-T洗滌3次，每次3min；
3．制備細胞懸液：將待測已致敏小鼠處死，取出pi臟，置于加有Hanks液的平皿內，用鈍頭直角9號zhu射器針頭破少許脾被膜后，趕出細胞，用毛細吸管輕輕吹散細胞團后，將懸液通過250目尼龍網，取濾液，1000r/min離心5min，Hanks液洗滌3次，計數細胞后，用1640液重新懸浮細胞，配成所需濃度；6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計數所顯示出的顏色的斑點。
4．往各孔中加入0.5ml含不同濃度（104-106/ml）的細胞懸液，置37℃，5％CO2條件下孵育2-4h，棄掉培養液，PBS-T洗滌3次，每次3min；
5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃過夜，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；
6．加入辣根過氧化物酶結合的親合素（Avi-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；
7．配制明膠-底物液：在37℃水浴中，將2.5mlTMB溶液（4mg/ml jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明膠溶液（用pH5.0磷酸鈉-檸檬酸緩沖液配制）邊加邊攪，溶液呈白色，加入14μl 3% H202；
8．顯色與計數：將培養板底冰浴，每孔加入0.6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計數所顯示出的顏色的斑點。
成纖維細胞分離方法
1.處死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超凈臺中用剪刀和鑷子將孕鼠皮膚剪開，用另外- -組剪刀、鑷子剪開腹部肌層，露出，后用第三組剪刀和鑷子將小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。
2.用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內臟，將其余胚胎轉移到一個裝有30 ml D-PBS的50 ml離心管中，輕輕顛倒兩次，倒掉D-PBS,再重復此步驟一次，注意要留少許D-PBS，然后將胚胎轉移到另- -裝有D-PBS的平皿中，并用手術刀片將其細細切碎。使用不同孔徑的聚碳酸酯膜transwell小室放入培養板中，將細胞接種于小室中，利用培養液成分的差異誘導細胞運動，檢測細胞的遷移和侵襲能力的差異。
3. 用200 μ的移液槍反復、快速地吹打平皿中的液體，轉移至15 ml離心管中，于4C 1500 rpm離心5分鐘，倒掉上清，以10 ml胰酶重懸沉淀，放在37C水浴中消化30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動，使之充分消化。
4.將上層細胞懸液倒入一個裝有10 ml MEF生長培養基的50 ml離心管中，用200目的尼龍網過濾后，以1500 rpm離心5分鐘收集細胞，再用30 ml MEF生長培養基洗滌兩次。
5.細胞沉淀用15 ml MEF生長培養基重懸后進行細胞計數(- -般8只14天的胎鼠可獲得2-3x107細胞)。
6. 3x106細胞懸浮于15 ml MEF生長培養基中，接種到200 ml培養瓶中。
7. 24小時后更換新鮮的MEF生長培養基。
8.細胞長滿后，先用D-PBS沖洗，倒掉后加胰酶消化(此步時間不宜過長，作者- -般不超過五分鐘)，按1:5傳代。
9. 細胞再次長到覆蓋率80-90%左右， 將其消化后，常規凍存(凍存液要現配)。
細胞培養中常見的污染及解決方法
支原體污染
支原體是隱蔽的污染物，不能通過過濾去除。顯微鏡下沒有任何可見的支原體污染跡象，比如細胞病變和濁度或 pH 值變化（即使在嚴重污染的培養基中），這樣就會導致我們產生錯誤的安全感。而在牛中，支原體是常見的微生物之一。
解決方法：通常的過濾滅菌方法對支原體沒有影響。磁性細胞標記方式應用MACS技術進行磁性細胞分選重要的一點是高質量的標記。細胞一旦被支原體污染，特別是對重要的細胞系，必須去除支原體，一般的方法有、抗和抗與補體聯合。值得注意的是，支原體很突出的結構特征是沒有細胞壁。因此，它對作用于細胞壁的生物合成（如 β-內酰胺類、萬古等）完全不敏感，并且通常對多粘菌素、利福平和類具有耐藥性。相反，四環素類和大環內酯類對支原體的抑制作用很強，而氨基糖苷類和氯的抑制作用較弱。
