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外顯子測序

外顯子組測序（exome-seq）是對定向富集的基因組DNA進行高通量測序，它能夠以相對低的費用對人類外顯子組進行拷問。2009年，外顯子組捕獲工具的出現，讓外顯子組測序這種技術迅速紅起來。到目前為止，已有超過1萬個外顯子組被測序。

如今有多家公司推出了外顯子組捕獲試劑，包括羅氏NimbleGen、安捷倫、Illumina，還有現在的華大基因。這些方法究竟孰優孰劣，斯坦福大學醫學院遺傳學系的研究人員對市場上三個主流的外顯子組測序平臺進行了比較。該研究結果發表在《Nature Biotechnology》上。研究人員利用安捷倫、Illumina和NimbleGen的外顯子組測序平臺對同一個人類血液樣品進行分析。他們的結 果表明，NimbleGen平臺作為一個使用高密度重疊探針的平臺，盡管覆蓋了較少的基因組區域，但在靈敏檢測小的變異時所需的測序量也少。分子組技術人員畢業于中國農業大學、華中科技大學同濟醫學院、浙江理工大學等高校生物醫學相關專業，全部具有碩士研究生以上學歷，熟練掌握分子生物學相關實驗，可開展多種分子生物學檢測服務。在同樣獲得80M測序數據的情況下，NimbleGen有97%的目標序列達到10x以上的測序深度，而其他產品只有90%。而安捷倫和Illumina的探針能夠在低密度下捕獲更多數量的變異。此外，Illumina還捕獲了未翻譯的區域，這是NimbleGen和安捷倫平臺無法靶定的。研究人員還比較了同一樣品的外顯子組測序和全基因組測序（WGS），顯示外顯子組測序能夠檢測到WGS錯過的小變異。

除了文中提到了三個主流平臺，外顯子組捕獲方面的新產品也在不斷推出，研究人員的選擇也將更廣泛。羅氏NimbleGen即將推出新一代的外顯子液相捕獲產品。若miRNA與mRNA的結合位點不配對，則抑制mRNA的翻譯。這一新產品將可捕獲64M的基因組序列，包括外顯子以及miRNA，它含與其他NimbleGen液相捕獲產品相同的2.1M高密度探針，以高xiao、均一、特異、的定向捕獲。

基因組甲l基化水平(Methyl ati on Content)的分析:

1.高l效液相色譜(Hi gh-performanceLi qui dChromatography, HPLC)HPLC是- -種比較傳統的方法,是根據DNA或蛋白分子量和構象的不同而使其加以分離。由于在動態相和靜態相下分子的光吸收度并不相同而加以定量。隨著系統的壓強的增加，其分辨率增l高。故而能夠定量測定基因組整體水平DNA甲l基化水平。lncRNA和mRNA同時檢測：芯片上包含有的lncRNA和新的mRNA序列檢測探針。該方法由Ruo等1980年首l次報道。過程是將DNA樣品先經鹽酸或氫l氟酸水解成堿基，水解產物通過色譜柱，結果與標準品比較，用紫外光測定吸收峰值及其量，計算5 mC/(5mC 5C)的積分面積就得到基因組整體的甲l基化水平。這是一種檢測DNA甲l基化水平的標準方法。

2.高l效毛細管電泳法(Hi gh-per formance Capillary Electrophoresis, HPCE)這是一-種利用窄孔熔融石英毛細管來從復合物中分離不同化學組分的技術。其基礎是在強電場下不同分子的由于其所帶電荷，大小，結構以及疏水性等不同而相互分開。(一)國家標準:國家標準采用三步法，即:乳糖發酵試驗、分離培養和證實試驗。用HIPCE方法處理DNA水解產物來確定5mC水平，簡便，經濟且敏感性高。

18.引物是經過PAGE純化的，為什么還有堿基缺失或插入？

答：理論上分析型PAGE變性電泳，可以區分引物之間一個堿基的差別。但是制備PAGE電泳，上樣量都是非常大，電泳時的條帶非常寬，帶與帶之間有重疊，分辨率已下降，電泳后割帶回收目的引物時，很難說不割到差別僅幾個堿基的引物。國內有一個不好的現象，PAGE純化的引物，特別是長引物要的量都比較高，導致割的條帶有時可能比較寬。往每個EP管中加入250ul，劇烈震蕩30s，冰上靜置12min[問l。建議：您如果減少OD數，引物遇到的問題可能就會少一些。

19. TaqMan 探針設計的基本原則是什么？

答：下列原則供您參考。

◆TaqMan 探針位置盡可能靠近擴增引物（擴增產物50-150bp），但不能與引物重疊。

◆長度一般為18-40mer 。

◆G-C含量控制在40-80%左右。

◆避免連續相同堿基的出現，特別是要避免GGGG或更多G出現。

◆在引物的5'端避免使用G。

◆選用比較多的堿基C。

◆退火溫度Tm控制在 68-70C   左右。

有用的熒光染料參數