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發布時間：2021-08-03 17:41
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新技術提升蛋白質結晶成功率
超構材料21世紀初被提出，截至目前它仍然是非常活躍的前沿領域。其中的微結構，大小尺度與它作用的蛋白質尺寸相當，因此得以對蛋白質的結晶過程施加干預，對蛋白質的聚集態形成起到促進作用，從而降低了兩步成核中的步能壘。其次，通過材料本體結構的晶格對聚集態蛋白質分子進行引導排列，促進蛋白質分子的有序排列和晶核形成，從而降低了兩步成核中的第二步能壘。
盡管通過實驗和理論證明了超構材料在蛋白質結晶方面的巨大潛力，但要充分發揮其優勢則必須兼容當前蛋白質結晶通過的高通量篩選系統。目前國際上普遍采用液體處理機器人來進行高通量結晶篩選，篩選一個結晶條件的蛋白樣品消耗體積為納升級別。因此，如何快速，穩定地將成核劑添加到高通量系統的同時，又不對結晶系統造成大的影響成為急需解決的問題。
隨后通過優化生產和制備工藝，考察了各生產因素對成核劑尺寸和穩定性的影響，確定了適合高通量蛋白質結晶篩選的成核劑混懸劑的制備工藝流程。這是一種含有具有表面超結構的有機無機復合材料，其尺寸分布在幾百納米到幾微米之間。該產品的組成為材料顆粒與水溶液的混懸液。在蛋白質結晶篩選實驗中，使用該產品有助于提高蛋白質結晶篩選的成功率，包括改善晶體的分辨率和篩選新的結晶條件，使不結晶或難結晶的蛋白質成功結晶，展現了巨大的應用潛力，使用該成核劑已經成功結晶和解析十多個蛋白質晶體結構。
此外，針對能夠結晶的蛋白質分子，成核劑混懸液在篩選新的結晶條件，提升結晶的分辨率方面同樣有效。目前，先進院已經與國內超過18個實驗室開展了合作，助力我國的生命科學和生物研究。
蛋白質結晶涉及四個重要步驟
1. 蛋白質純度的確定。如果不夠非常純，必須要進一步純化。
2. 蛋白質溶解于合適的溶劑中，從中它能通過一種鹽或有機化合物而析出。溶劑通常是水-緩沖劑溶液，有時加，如2--2，4-（MPD）。正常情況下，沉淀劑也被加入，但是濃度不高于使沉淀產生。對于不溶于水-緩沖劑或水-的膜蛋白，還需要加入去污劑。
3. 使溶液過飽和。在這一步中，小聚集體形成，它是晶體生長所需的核。對小分子的結晶來說，相比于蛋白質更為人熟知，晶核的自發形成需要提供表面張力能。一旦這個能障被突破了，晶體開始生長。能障在高水平的過飽和度時很容易克服。因此，在高過飽和度時，晶核更易自發形成。晶核的形成可作為一個過飽和度和其他參數的函數通過多種方法來研究，包括光散射、熒光去極化及電子顯微鏡。
4. 一旦晶核形成，晶體生長正式開始。對低分子量的化合物而言，新分子會逐步結合到正在生長的晶體表面。這是由于這些位置的結合能比較大，相對于分子結合到平滑的表面。這些步驟要么由晶系缺陷造成，要么發生在表面隨機形成的晶核。
傳統結晶板蛋白質晶體板比較
在20℃時雖然微流控芯片上的結晶條件數少于24孔結晶板(67 vs 94),但主要是嗜熱菌蛋白酶的結晶條件數顯著減少,其他4種蛋白在兩種方法上均有相近的結晶條件數,表明微流控芯片能以接近24孔結晶板的效率進行蛋白質結晶篩選.但是,在4℃時微流控芯片與24孔結晶板有60%的結晶條件不同,20℃時有90%的結晶條件不同,這表明目前的這種微流控芯片還不能直接代替傳統的24孔結晶板,它可以作為蛋白質結晶篩選時的一種補充方式。
蛋白結晶板作用
蛋白質作為生命活動的載體,研究其分子結構及發揮生物活性的機制具有重要意義.結晶作為研究生物大分子結構及功能的重要手段,近年來發展迅速.介紹影響蛋白質結晶的因素、目前常用的蛋白質結晶方法以及提高蛋白質結晶條件篩選率和衍射質量的新技術和新策略,這對蛋白質結晶的研究有一定的推動作用。
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