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ELISA試劑盒的測試要求

做好對照

正式試驗時，應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應。

實驗條件的選擇

在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括:

（1）固相載體的選擇：許多物質可作為固相載體，如聚乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。常用的是40孔聚乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據此判明其吸附性能是否良好。

（2）包被（或抗原）的選擇：將（或抗原）吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃ 18～24小時。蛋白質包被的適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度（0.1、1.0和10μg/ml等）進行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值大而蛋白量少的濃度。對于多數蛋白質來說通常為1～10μg/ml。

（3）酶標記工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定（見酶標記部份）。然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標記分別為不同的稀釋度）在正式實驗系統里準確地滴定其工作濃度。

（4）酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應加入強酸或強堿以終止反應。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。

Elisa試劑盒——Elisa實驗常見問題及解決方案

不正常的標準曲線

1  錯誤的方法重懸標準品  加入正確量的溶液重懸標準品，重懸充分

2  標準品稀釋錯誤  按照說明書要求稀釋標準品

3  標準品污染  使用一次性的滅菌吸頭， 標準品貯存于2-8 ℃

4  錯誤的倍比稀釋步驟  按照說明書倍比稀釋標準品

5  波長選擇錯誤 TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用，而 前者比色波長為450nm，后者為492nm。雙波長比色分析優于單波長。

6  標準品混用  不同批號試劑勿混用

7  試劑盒在運輸途中時間太長，溫度太高，標準品失活  盡量縮短運輸時間，夏季應放冰塊降溫

8  ELISA未終止而直接檢測450nm和620nm TMB顯色需終止后檢測，否則會出現620nm比450nm讀數高的現象。（數值仍有梯度規律）

ELISA試劑盒主要實驗原理

·包被：抗原或者能以物理性吸附于固相載體表面，原因是蛋白質和聚乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，吸附之后能保持抗原反應等活性；

·標記：抗原或者可通過共價鍵與酶連接成酶結合物，而此種酶結合物仍能保持其活性和酶的催化特點；

·顯色：酶結合物與相應包被在固相載體的抗原或者結合后，也被固定在固相載體上，加入酶的底物之后可出現顯色反應，根據反應的顏色深淺可計算抗原或者的相對含量。