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發布時間：2021-08-21 09:41
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公司目前擁有多項產品及技術，其中發明兩項，軟件著作權八項，實用新型三項，商標兩件。公司先后獲得“江蘇省民營科技企業”、“江蘇省科技型中小企業”、“江蘇省專精特新中小企業”等榮譽資質，連續多年被評為“東南大學國家大學科技園企業”。貼壁細胞:先倒出培養液，采用胰蛋白酶消化或者用細胞刮(會產生碎屑)刮下:帶培養液進行離心，100-1500/mim510min。2019年公司成為江蘇省生物技術協會第七屆理事會的特邀理事，成立了“李冬冬創新工作室”，并獲得了南京市“工人先鋒號”的榮譽稱號。
細胞ELISPOT檢測
1．培養板的預處理：在24孔培養板內加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，棄掉板中的處理液，用PBS洗滌3次，每次3min；
2．抗原包被：將適量抗原溶于包被緩沖液中，每孔加入0.5ml，4℃過夜，PBS-T洗滌3次，每次3min；
3．制備細胞懸液：將待測已致敏小鼠處死，取出pi臟，置于加有Hanks液的平皿內，用鈍頭直角9號zhu射器針頭破少許脾被膜后，趕出細胞，用毛細吸管輕輕吹散細胞團后，將懸液通過250目尼龍網，取濾液，1000r/min離心5min，Hanks液洗滌3次，計數細胞后，用1640液重新懸浮細胞，配成所需濃度；2)陽性CD117(c-kit)陰性特點用流式細胞儀將精原gan細胞分選出來,并在體外進行培養嘗試。
4．往各孔中加入0.5ml含不同濃度（104-106/ml）的細胞懸液，置37℃，5％CO2條件下孵育2-4h，棄掉培養液，PBS-T洗滌3次，每次3min；
5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃過夜，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；
6．加入辣根過氧化物酶結合的親合素（Avi-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；
7．配制明膠-底物液：在37℃水浴中，將2.5mlTMB溶液（4mg/ml jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明膠溶液（用pH5.0磷酸鈉-檸檬酸緩沖液配制）邊加邊攪，溶液呈白色，加入14μl 3% H202；
8．顯色與計數：將培養板底冰浴，每孔加入0.6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計數所顯示出的顏色的斑點。
三、自噬過程進行觀察和檢測
1、觀察自噬體的形成
由于自噬體屬于亞細胞結構，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特征為:新月狀或杯狀，雙層或多層膜,有包繞胞漿成分的趨勢。其檢測原理為huo細胞內線粒體中的琥珀酸脫氫酶能催化外源性無色的MTT形成藍色的結晶Formazan，并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。自噬體(AV1 )的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結構，內含胞漿成分，如線粒體、內質網、核糖體等。自噬溶酶體(AV2 )的特征為:單層膜，胞漿成分己降解。( autophagic vacuolo AV )
2、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋 白來示蹤自噬形成由于電鏡耗時長，不利于監測(Monitoring) 自噬形成，人們利用LC3在自噬形成過程中發生聚集的現象開發出了此技術。共培養-定時間后進行破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistantacidphosphatase,TRAP染色鑒定和骨吸收功能檢測，并進一步采用RT-PCR對破骨細胞標志酶基因基質金屬蛋白酶。無自噬時，GFP-LC3融合蛋 白彌散在胞漿中;自噬形成時，GFP-LC3融合蛋白轉 位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當于一個自噬體，可以通過計數來評價自噬活性的高低。
3、利用Western Blot檢測LC3-II/比值的變化以評價自噬形成自噬形成時，胞漿型LC3 (即 LC3-I)會酶解掉一小段多肽，轉變為(自噬體)膜型(即LC3-ID，因此，LC3-II/比值 的大小可估計自噬水平的高低。(注意: LC3對LC3-II有更高的親和力，會造成假陽性。(3)PBS緩沖液充分漂洗軟gu小塊3次，然后用小剪刀將軟gu塊切碎至約Imm3大小。方法2和3需結合使用，同時需考慮溶酶體活性的影響。)
4、MDC (Monodansylcadaverine ，單丹磺酰尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的。
5、CellTrackerTM Green染色:主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特異性的。
大鼠gu髓間充質gan細胞的分離
操作方法
(1 )取SD大鼠( 2周齡)，頸椎脫臼法處死后立即用75%乙醇浸泡，移入超凈工作臺內，用大頭針固定大鼠四肢于工作臺面的泡沫板上。
(2)碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，無菌條件下用滅菌消毒后的鑷子和剪刀分離出大鼠股骨和脛骨，剔除骨頭表面肌肉, PBS溶液沖洗兩遍。
(3 )從中間剪斷股骨和脛骨，用2ml無菌注she器吸取DMEM/F 12溶液沖出gu髓細胞多次，再用針頭吹打，吸管吸入離心管內，1000r/min離心5min，棄上清，用PBS重懸細胞。
(4 )緩慢將細胞懸液加入預先裝有5mL淋巴細胞分離液的15mL離心管內，保持細胞懸液在淋巴細胞分離液上層，注意不要攪動液面,保持二者分層界面。
(5 ) 2000rpm離心15-25min，離心后溶液分4層，吸取中間骨sui基質細胞層(白色渾濁狀)， PBS洗三次。
(6)用含15%胎牛xue清及青鏈mei素的DMEM/F 12以106/mL的細胞濃度接種于25cm2培養瓶中， 置37°C、5%CO2恒溫培養箱中培養。
( 7 ) 24小時后棄去培養液(看細胞貼壁情況)，PBS沖洗2-3次去除末貼壁細胞，加入培養液繼續培養。以后每3d半量換液1次，-般10d細胞生長融合。
(8 )經0.25%胰酶消化，1 : 2傳代，其后一般3-5d傳代1次,選取生長良好的第三代細胞進行后續實驗。
