單細胞測序技術RNA水平【英瀚斯】

細胞實驗介紹——流式細胞術檢測細胞周期和凋亡

流式細胞術檢測細胞周期：

細胞周期：指細胞從前一次分裂結束起到下一次分裂結束為止的活動過程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期組成。G0/G1期：有絲分裂發生，細胞分裂成兩個細胞，進入下一個細胞周期，或者進入靜止期（G0期），而G0期從DNA含量上無法與G1期區分，細胞開始RNA和蛋白質的合成，但DNA含量仍保持二倍體。S期：DNA開始合成，細胞核內DNA的含量介于G1期和G2期之間。G2期和M期：當DNA成為4倍體時，細胞進入G2期。G2期細胞繼續合成RNA及蛋白質，直到進入M期。

PI法是經典的周期檢測方法。PI為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結合，其結合的量與DNA的含量成正比例關系，用流式細胞儀進行分析，就可以得到細胞周期各個階段的DNA分布狀態，從而計算出各個期的百分含量。

一般流程：細胞收集-70%酒精固定過夜-PI染色-流式細胞儀檢測。

細胞凋亡：細胞凋亡的早期就有細胞膜表面破損發生。破損時凋亡細胞表面的磷脂腺絲氨酸(PS)可以從細胞內膜翻轉至細胞的外膜。該過程發生在之前，檢測PS的表達，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2 依賴的磷脂結合蛋白，對PS有很高的親和性，并且可以與暴露于細胞外的PS相結合。利用這一原理，可以將AnnexinV標記熒光來識別早期的細胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)來區分凋亡和壞死細胞。PI的膜通透性很差，因而只能標記壞死的細胞。

一般流程：細胞收集-PI-AnnexinV標記-流式細胞儀檢測。

結果示例：

                                   圖 A 細胞周期檢測圖；B 細胞凋亡檢測圖

Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）是一種基于WST-8的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的檢測試劑。WST-8【化學名：2-(2-甲氧ji-4-硝ji苯ji)-3-(4-硝ji苯ji)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，是一種類似于MTT的化合物，它在電子載體1-甲氧ji-5-甲ji吩嗪鎓硫酸二jia酯（1-Methoxy PMS）存在的情況下，被線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產物（formazan）。細胞增殖越多越快，顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺，對于同樣的細胞，顏色的深淺與活xi胞的數量成正比，因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。

細胞分化

細胞分化是指同一來源的細胞逐漸產生出形態結構、功能特征各不相同的細胞類群的過程，其結果是在空間上細胞產生差異，在時間上同一細胞與其從前的狀態有所不同。細胞分化的本質是基因組在時間和空間上的選擇性表達，通過不同基因表達的開啟或關閉，終產生標志性蛋白質。細胞誘導是指將一群不同類型或者形態結構、功能特征存在差異的細胞通過生物學、物理學等手段，將之轉變為具有相似/相同形態結構、功能特征的細胞群體的過程。