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PCR循環參數

預變性模板DNA完全變性與PCR酶的完全激1活對PCR能否成功至關重要，建議加熱時間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激1活時間為兩分鐘。 

變性步驟：循環中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可縮短該步驟時間。變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗。 

引物退火：退火溫度需要從多方面去決定，一般根據引物的Tm值為參考，根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然后在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對PCR的特異性有較大影響。

引物延伸：引物延伸一般在72℃進行（Taq酶zui適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。

循環數：大多數PCR含25-35循環，過多易產生非特異擴增。

zui后延伸在zui后一個循環后，反應在72℃維持10-30分鐘．使引物延伸完全，并使單鏈產物退火成雙鏈。

PCR出現假陰性

不出現擴增條帶。PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及Br乙錠的使用， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制1劑，③模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。

不對稱PCR(asymmetric PCR）枝術

兩種引物濃度比例相差較大的PCR技術稱不對稱PCR.在擴增循環中引入不同的引物濃度.常用50~ 100 1比例。在起初的10~ 15個循環中主要產物還是雙鏈DNA.但當低濃度引物被消耗盡后。高濃度引物介導的PCR反應就會產生大量單鏈DNA.

應用:可制備單鏈DNA部分片段用于序列分析或核酸雜交的探針。

反轉錄PCR(reverse transcription, RT- PCR技術

當擴增模板為RNA時。需先通過反轉錄酶將其反轉錄為cDNA才能進行擴增。RT - PCR應用非常廣泛。無論是分子生物學還是臨床檢驗等都經常采用。

修飾引物PCR技術

為達到某些特殊應用目的.如定向克1隆、定1點突變、體外轉錄及序列分析等。可在引物的5*-端加上酶切位點、突變序列、轉錄啟動子及序列分析結合位點等。

PCR技術不僅可用于基礎研究，還適用于日常的臨床診斷、法醫學調查和農業生物技術研究。這些應用要求可靠的性能、及時的靈敏度和嚴格的標準。因此，所使用的PCR儀和PCR試劑必須符合這些要求和目的。

分子診斷應用包括基因檢測、致癌突變檢測以及感1染性疾病檢測。在法醫學中，利用 PCR進行人類身份鑒定是通過對特別的短串聯重復序列（STR）進行擴增而區分個體的。在農業學中，PCR在食物病原體檢測、育種植物基因分型和 GMO測試中具有重要作用。