麗水轉基因技術呼吸系統模型「在線咨詢」

細胞實驗介紹——細胞運動能力檢測：

細胞劃痕實驗是體外模擬細胞遷移能力和修復能力快捷的檢測方法。在長滿的細胞培養板或者培養皿中，沿著中線使用移液器槍頭或者其他硬物劃1-3條平行的直線，去除中線的細胞，細胞在0h、12h、24h后，觀察細胞往中線遷移情況，判斷細胞遷移能力。

一般流程：細胞接種培養-劃痕-不同時間點拍照

細胞遷移和侵襲實驗是體外模擬細胞遷移和侵襲能力的檢測方法。使用不同孔徑的聚碳酸酯膜transwell小室放入培養板中，將細胞接種于小室中，利用培養液成分的差異誘導細胞運動，檢測細胞的遷移和侵襲能力的差異。

一般流程：transwell小室準備-細胞接種-細胞培養-transwell小室染色-顯微鏡拍照

結果示例：

                                       圖 A 細胞劃痕實驗圖；B，C 細胞遷移和侵襲實驗圖

細胞培養中常見的污染及解決方法

黑點污染

黑色的游動點能穿透濾膜并在空氣中擴散。它們在低倍鏡下顯示為黑色圓點，在高倍鏡下顯示為可移動的黑點。培養液也不渾濁，一般影響較小，因此細胞仍可使用。通常，黑點污染后，細胞生長良好，運動物體無明顯增加，培養基的顏色和透明度無明顯變化。細胞沉淀用15mlMEF生長培養基重懸后進行細胞計數(--般8只14天的胎鼠可獲得2-3x107細胞)。在同一批培養的細胞中也可以發現類似的現象。

解決方法：黑點對細胞生長狀態沒有明顯影響，細胞增殖后會自然消失，因此除了置換外，無需特殊處理。如果細胞可能被小的運動點污染，建議增加培養皿細胞密度，以提高細胞存活率。

什么是脂質體？脂質體轉染的原理和步驟？

細胞轉染的方法主要包括：電穿孔法、顯微注射、基因槍、磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染法、多種陽離子物質介導、病毒介導的轉染等，理想的細胞轉染方法是具有高轉染效率、對細胞的毒性作用小等。

一、脂質體 (liome) 轉染方法原理

脂質體 (liome) 轉染方法原理：脂質體 ((Iiome) 作為體內和體外輸送載體的工具，已經研究的十分廣泛，用合成的陽離子脂類包裹 DNA，同樣可以通過融合而進入細胞。使用脂質體將 DNA 帶入不同類型的真核細胞，與其它方法相比，有較高的效率和較好的重復性的。2%的瓊脂糖和2xDMEM培養基(含有2x和20%的小牛血l清)混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7~10mL)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。

中性脂質體是利用脂質膜包裹 DNA，借助脂質膜將 DNA 導入細胞膜內。帶正電的陽離子脂質體，DNA 并沒有預先包埋在脂質體中，而是帶負電的 DNA 自動結合到帶正電的脂質體上，形成 DNA-陽離子脂質體復合物，從而吸附到帶負電的細胞膜表面，經過內吞被導入細胞。實驗流程：慢病毒質粒構建-HEK293T細胞培養-質粒轉染293T細胞-病毒收集-病毒純化-病毒滴度檢測-細胞-穩轉細胞篩選-穩轉細胞鑒定結果示例：圖A病毒滴度檢測。

細胞凍存有哪些注意事項？

細胞培養的傳代及日常維持過程中，在培養器具、培養液及各種準備工作方面都需大量的耗費，而且細胞一旦離開開始原代培養，它的各種生物特性都將逐漸發生變化并隨著傳代次數的增加和體外環境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時進行細胞凍存十分必要。細胞冷凍儲存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;細胞儲存在液氮中，溫度達-196℃，理論上儲存時間是的。而經過雜交瘤測序，可以獲得相應的序列，可以以重組蛋白的方式來穩定獲得。

細胞凍存的步驟：

配制含 10%DMSO 或甘油、10~20% 小牛的凍存培養液;

取對數生長期的細胞，去除舊培養液，用 PBS 清洗。

去除 PBS，加入適量胰蛋白酶 (覆蓋培養皿表面) 把單層生長的細胞消化下來;

離心 1000rpm，5min;

去除胰蛋白酶，加入適量配制好的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節凍存液中細胞的終密度為 5×106/ml~1×107/ml;

將細胞分裝入凍存管中，每管 1~1.5 ml;

在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者;

凍存:標準的凍存程序為降溫速率-1~-2℃/ min;當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱 2h ，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。細胞誘導是指將一群不同類型或者形態結構、功能特征存在差異的細胞通過生物學、物理學等手段，將之轉變為具有相似/相同形態結構、功能特征的細胞群體的過程。