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試劑準備

?1X測定/裂解緩沖液：短暫混合5X儲備液，并在去離子水中稀釋至1X。 在使用前，添加蛋白酶抑制l劑，例如1 mM PMSF，10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。

1.將細胞（一塊10厘米長的平板，約107個細胞）培養至約80-90％匯合。根據需要用活化劑或抑制l劑刺激細胞。

2.吸出培養基，并用冰冷的PBS洗滌兩次。

3.完全除去PBS洗滌液，然后向細胞中加入冰冷的1X分析/裂解緩沖液（每10 cm組織培養板0.5-1 mL）。

4.將培養板放在冰上10-20分鐘。

5.用刮板將其從平板上取下。

6.將裂解物轉移至適當大小的試管中，并置于冰上。

7.如果發生核裂解，則細胞裂解液可能變得非常粘稠，難以移液。如果發生這種情況，可將裂解液通過27?號注l射器針頭3-4次以剪切基因組DNA。

8.通過離心10分鐘（在4°C下為12,000 x g）清除裂解物。

9.收集上清液并將樣品（約1-2 mg的總蛋白）存儲在冰上以立即使用，或速凍并存儲在-70°C以便將來使用。

陽性對照和陰性對照的體外GTPγS/ GDP蛋白質上樣量

注意：體內細胞刺激將激l活可用Arf 6的大約10％，而體外GTPγS蛋白負載將激l活Arf 6的將近90％。

1，將0.5 ml每種細胞提取物等分到兩個微量離心管中（或使用1 μg純化的Arf 6蛋白）。

2，向每個試管中加入20 μl 0.5 M EDTA（終濃度為20 mM）。

3，將5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，終濃度）加到一個試管中（陽性對照）。

4，在第二個試管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，終濃度）（陰性對照）。

5，在攪拌下將試管在30°C孵育30分鐘。

6，通過將試管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM，終濃度）來停止加載。

 1.抗活性的Arl1，小鼠單克l隆抗l體（貨號26924）：一小瓶–溶于pH 7.4的PBS中的22 μL（1mg / ml），含有50％甘油和0.05％疊氮l化鈉。該抗l體特異性識別所有脊椎動物的Arl1-GTP。

2.蛋白A / G瓊脂糖（目錄號30301）：一小瓶– 400 μL 50％漿液。

3. 5X測定/裂解緩沖液（目錄號30302）：一瓶– 30 mL的250 mM Tris-HCl，pH 8，750mM NaCl，50 mM MgCl2，5 mM EDTA，5％Triton X-100。

4.抗Arl1，小鼠單克l隆抗l體（目錄號26056）：一小瓶– 100 μL（1 mg / ml）

pH 7.4的PBS中含有50％的甘油。

5. 100 XGTPγS（貨號30303）：1瓶– 100 μl，10 mM，使用5 μLGTPγSGTP標記的0.5 mL細胞裂解物。

6. 100 X GDP（產品目錄號30304）：一個樣品瓶– 100 μl，100 mM，使用5 μL GDP

GDP標記的0.5 mL細胞裂解物。

1.刺激的和非刺激的細胞裂解液

2.蛋白酶抑制l劑

3. 4°C管搖桿或搖床

4. 0.5 M EDTA，pH8.0

5. 1 M氯化鎂

6. 2倍還原SDS-PAGE樣品緩沖液

7.電泳和免l疫印跡系統

8.免l疫印跡洗滌緩沖液，例如TBST（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.05％Tween-20）

9.免l疫印跡封閉緩沖液（TBST包含5％脫脂奶粉或3％BSA）

10. PVDF或硝l酸纖維素膜

11.二抗

12. ECL檢測試劑

試劑制備

1X Assay/Lysis Buffer：實驗前用去離子水將5X的Assay/Lysis緩沖液稀釋成1X的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制l劑如1 mM PMSF, 10 μg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 μg/mL aprotinin（抑肽酶）。

樣品處理

貼壁細胞

1. 培養細胞密度達到大約80%-90%之間（直徑10 cm培養皿，~107個細胞），并用活性劑或抑制l劑進行處理。

2. 吸去培養基并用冰冷的PBS洗滌兩次。

3. 向細胞中加入1X Assay/Lysis緩沖液（每個直徑10cm的組織培養皿中加入0.5-1mL）。

4. 將培養皿放置于冰上處理10-20分鐘。

5. 用細胞刮棒把細胞從培養皿下分離下來。

6. 將細胞裂解物轉入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發生裂解，細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現時，將細胞裂解物用27?的注射l器針頭來回吸取3-4次，以破壞基因組DNA，從而避免上述情況的出現。

8. 4°C 12000 g, 離心10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C條件下。