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PCR出現假陰性

不出現擴增條帶。PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及Br乙錠的使用， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制1劑，③模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。

LA PCR的原理

LA PCR的關鍵是具有3′→5′Exonuclease活性 (Proof reading活性) 的耐熱性DNA聚合酶。在PCR過程中當有錯誤的堿基攝入時，反應性能將大幅度下降，TaKaRa Ex Taq 和TaKaRa LA Taq 依靠3′→5′Exonuclease活性可將錯配的堿基除去，從而延伸反應能順利地進行下去，使長鏈DNA的擴增成為可能。

競爭性PCR(competitive PCR, c-PCR技術

c-PCR技術是競爭cDNA模板與目的cDNA同時擴增.使用同樣的引物,但一經擴增后。能從這些目的cDNA區別開來。通常使用突變性競爭cDNA模板.其序列與目的cDNA序列相同.不過模板中僅有一個新內切位點或缺少內切位點突變性的cDNA模板可用適當的內切酶水解,并用分光計測定其濃度。cDNA目的序列和競爭模板相對應的含量.可用澳化乙錠染色.電泳膠直接掃描進行測定或摻入放1射性同位素標記的方法測定。競爭模板開始時的濃度是已知的.則cDNA目的序列的zui初濃度就能測定。這種方法能準確測定mRNA中cDNA靶序列.可用于幾個到10個細胞中mRNA的定量。

 PCR反應五要素

參加PCR反應的物質主要有五種即引物(PCR引物為DNA部分片段,細胞內DNA復1制的引物為一段RNA鏈)、酶、dNTP、模板和緩沖液(其中需要Mg2 )。

[PCR步驟]標準的PCR過程分為三步:

1.DNA變性(90°C-96*C): 雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA

2.退火(25C-65'C): 系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

3.延伸(70°C-75*C): 在Taq酶(在72C左右，活性zui佳)的作用下，以dNTP為原料，從引物的5'端→3'端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環經過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。現在有些PCR因為擴增區很短，即使Taq酶活性不是zui佳也能在很短的時間內copy完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60°C -65C間進行，以減少一次升降溫過程，提

高了反應速度。