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細(xì)胞實(shí)驗(yàn)介紹——流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：

細(xì)胞周期：指細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動(dòng)過(guò)程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期組成。G0/G1期：有絲分裂發(fā)生，細(xì)胞分裂成兩個(gè)細(xì)胞，進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期，或者進(jìn)入靜止期（G0期），而G0期從DNA含量上無(wú)法與G1期區(qū)分，細(xì)胞開(kāi)始RNA和蛋白質(zhì)的合成，但DNA含量仍保持二倍體。在長(zhǎng)滿的細(xì)胞培養(yǎng)板或者培養(yǎng)皿中，沿著中線使用移液器槍頭或者其他硬物劃1-3條平行的直線，去除中線的細(xì)胞，細(xì)胞在0h、12h、24h后，觀察細(xì)胞往中線遷移情況，判斷細(xì)胞遷移能力。S期：DNA開(kāi)始合成，細(xì)胞核內(nèi)DNA的含量介于G1期和G2期之間。G2期和M期：當(dāng)DNA成為4倍體時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入G2期。G2期細(xì)胞繼續(xù)合成RNA及蛋白質(zhì)，直到進(jìn)入M期。

PI法是經(jīng)典的周期檢測(cè)方法。雖然3D多細(xì)胞腫liu球模型具有更顯著的實(shí)體腫liu生理相關(guān)性，但是與2D貼壁細(xì)胞培養(yǎng)模型相比，獲得大量相對(duì)統(tǒng)一的3D多細(xì)胞腫liu球模型需要-系列的培養(yǎng)過(guò)程和表征手段。PI為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結(jié)合，其結(jié)合的量與DNA的含量成正比例關(guān)系，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，就可以得到細(xì)胞周期各個(gè)階段的DNA分布狀態(tài)，從而計(jì)算出各個(gè)期的百分含量。

一般流程：細(xì)胞收集-70%酒精固定過(guò)夜-PI染色-流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

細(xì)胞凋亡：細(xì)胞凋亡的早期就有細(xì)胞膜表面破損發(fā)生。破損時(shí)凋亡細(xì)胞表面的磷脂腺絲氨酸(PS)可以從細(xì)胞內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞的外膜。消化傳代后細(xì)胞呈短梭形或三角形,單層生長(zhǎng),鋪路石狀,Ⅷ因子表達(dá)陽(yáng)性,呈指數(shù)增殖。該過(guò)程發(fā)生在之前，檢測(cè)PS的表達(dá)，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2 依賴(lài)的磷脂結(jié)合蛋白，對(duì)PS有很高的親和性，并且可以與暴露于細(xì)胞外的PS相結(jié)合。利用這一原理，可以將AnnexinV標(biāo)記熒光來(lái)識(shí)別早期的細(xì)胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)來(lái)區(qū)分凋亡和壞死細(xì)胞。PI的膜通透性很差，因而只能標(biāo)記壞死的細(xì)胞。

一般流程：細(xì)胞收集-PI-AnnexinV標(biāo)記-流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

結(jié)果示例：

                                   圖 A 細(xì)胞周期檢測(cè)圖；B 細(xì)胞凋亡檢測(cè)圖

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)介紹——細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)：

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是體外模擬細(xì)胞遷移能力和修復(fù)能力快捷的檢測(cè)方法。在長(zhǎng)滿的細(xì)胞培養(yǎng)板或者培養(yǎng)皿中，沿著中線使用移液器槍頭或者其他硬物劃1-3條平行的直線，去除中線的細(xì)胞，細(xì)胞在0h、12h、24h后，觀察細(xì)胞往中線遷移情況，判斷細(xì)胞遷移能力。

一般流程：細(xì)胞接種培養(yǎng)-劃痕-不同時(shí)間點(diǎn)拍照

細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)是體外模擬細(xì)胞遷移和侵襲能力的檢測(cè)方法。使用不同孔徑的聚碳酸酯膜transwell小室放入培養(yǎng)板中，將細(xì)胞接種于小室中，利用培養(yǎng)液成分的差異誘導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力的差異。

一般流程：transwell小室準(zhǔn)備-細(xì)胞接種-細(xì)胞培養(yǎng)-transwell小室染色-顯微鏡拍照

                                       圖 A 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)圖；B，C 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)圖

細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的污染及解決方法

黑點(diǎn)污染

黑色的游動(dòng)點(diǎn)能穿透濾膜并在空氣中擴(kuò)散。它們?cè)诘捅剁R下顯示為黑色圓點(diǎn)，在高倍鏡下顯示為可移動(dòng)的黑點(diǎn)。培養(yǎng)液也不渾濁，一般影響較小，因此細(xì)胞仍可使用。通常，黑點(diǎn)污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，運(yùn)動(dòng)物體無(wú)明顯增加，培養(yǎng)基的顏色和透明度無(wú)明顯變化。細(xì)胞組技術(shù)人員畢業(yè)于東南大學(xué)、華中科技大學(xué)等高校生物學(xué)相關(guān)專(zhuān)業(yè)，具有碩士研究生以上學(xué)歷，熟練掌握細(xì)胞學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，可開(kāi)展多種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。在同一批培養(yǎng)的細(xì)胞中也可以發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的現(xiàn)象。

解決方法：黑點(diǎn)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)沒(méi)有明顯影響，細(xì)胞增殖后會(huì)自然消失，因此除了置換外，無(wú)需特殊處理。如果細(xì)胞可能被小的運(yùn)動(dòng)點(diǎn)污染，建議增加培養(yǎng)皿細(xì)胞密度，以提高細(xì)胞存活率。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

目的

學(xué)習(xí)和掌握外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的主要方法——脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。了解外源基因進(jìn)入的一般性方法，觀測(cè)外源蛋白的表達(dá)（綠色熒光蛋白），為染色準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料。

實(shí)驗(yàn)原理

上圖所示是脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的示意圖，它顯示了外源質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞的一般過(guò)程。

外源基因進(jìn)入細(xì)胞主要有四種方法：法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法。法是在細(xì)胞上短時(shí)間暫時(shí)性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入；磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過(guò)直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細(xì)胞；細(xì)胞沉淀用15mlMEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(--般8只14天的胎鼠可獲得2-3x107細(xì)胞)。病毒法是利用包裝了外源基因的病毒細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入細(xì)胞。但是由于法和磷酸鈣法的實(shí)驗(yàn)條件控制較嚴(yán)、難度較大；病毒法的前期準(zhǔn)備較復(fù)雜、而且可能對(duì)于細(xì)胞有較大影響；所以現(xiàn)在對(duì)于很多普通細(xì)胞系，一般的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法。

利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和培養(yǎng)基中的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問(wèn)題，通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對(duì)于效率的提高有巨大的作用。