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細胞實驗介紹——流式細胞術(shù)檢測細胞周期和凋亡

流式細胞術(shù)檢測細胞周期：

細胞周期：指細胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動過程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期組成。G0/G1期：有絲分裂發(fā)生，細胞分裂成兩個細胞，進入下一個細胞周期，或者進入靜止期（G0期），而G0期從DNA含量上無法與G1期區(qū)分，細胞開始RNA和蛋白質(zhì)的合成，但DNA含量仍保持二倍體。在長滿的細胞培養(yǎng)板或者培養(yǎng)皿中，沿著中線使用移液器槍頭或者其他硬物劃1-3條平行的直線，去除中線的細胞，細胞在0h、12h、24h后，觀察細胞往中線遷移情況，判斷細胞遷移能力。S期：DNA開始合成，細胞核內(nèi)DNA的含量介于G1期和G2期之間。G2期和M期：當(dāng)DNA成為4倍體時，細胞進入G2期。G2期細胞繼續(xù)合成RNA及蛋白質(zhì)，直到進入M期。

PI法是經(jīng)典的周期檢測方法。雖然3D多細胞腫liu球模型具有更顯著的實體腫liu生理相關(guān)性，但是與2D貼壁細胞培養(yǎng)模型相比，獲得大量相對統(tǒng)一的3D多細胞腫liu球模型需要-系列的培養(yǎng)過程和表征手段。PI為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結(jié)合，其結(jié)合的量與DNA的含量成正比例關(guān)系，用流式細胞儀進行分析，就可以得到細胞周期各個階段的DNA分布狀態(tài)，從而計算出各個期的百分含量。

一般流程：細胞收集-70%酒精固定過夜-PI染色-流式細胞儀檢測。

細胞凋亡：細胞凋亡的早期就有細胞膜表面破損發(fā)生。破損時凋亡細胞表面的磷脂腺絲氨酸(PS)可以從細胞內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)至細胞的外膜。消化傳代后細胞呈短梭形或三角形,單層生長,鋪路石狀,Ⅷ因子表達陽性,呈指數(shù)增殖。該過程發(fā)生在之前，檢測PS的表達，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2 依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對PS有很高的親和性，并且可以與暴露于細胞外的PS相結(jié)合。利用這一原理，可以將AnnexinV標(biāo)記熒光來識別早期的細胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)來區(qū)分凋亡和壞死細胞。PI的膜通透性很差，因而只能標(biāo)記壞死的細胞。

一般流程：細胞收集-PI-AnnexinV標(biāo)記-流式細胞儀檢測。

結(jié)果示例：

                                   圖 A 細胞周期檢測圖；B 細胞凋亡檢測圖

細胞實驗介紹——細胞運動能力檢測：

細胞劃痕實驗是體外模擬細胞遷移能力和修復(fù)能力快捷的檢測方法。在長滿的細胞培養(yǎng)板或者培養(yǎng)皿中，沿著中線使用移液器槍頭或者其他硬物劃1-3條平行的直線，去除中線的細胞，細胞在0h、12h、24h后，觀察細胞往中線遷移情況，判斷細胞遷移能力。

一般流程：細胞接種培養(yǎng)-劃痕-不同時間點拍照

細胞遷移和侵襲實驗是體外模擬細胞遷移和侵襲能力的檢測方法。使用不同孔徑的聚碳酸酯膜transwell小室放入培養(yǎng)板中，將細胞接種于小室中，利用培養(yǎng)液成分的差異誘導(dǎo)細胞運動，檢測細胞的遷移和侵襲能力的差異。

一般流程：transwell小室準(zhǔn)備-細胞接種-細胞培養(yǎng)-transwell小室染色-顯微鏡拍照

                                       圖 A 細胞劃痕實驗圖；B，C 細胞遷移和侵襲實驗圖

細胞培養(yǎng)中常見的污染及解決方法

黑點污染

黑色的游動點能穿透濾膜并在空氣中擴散。它們在低倍鏡下顯示為黑色圓點，在高倍鏡下顯示為可移動的黑點。培養(yǎng)液也不渾濁，一般影響較小，因此細胞仍可使用。通常，黑點污染后，細胞生長良好，運動物體無明顯增加，培養(yǎng)基的顏色和透明度無明顯變化。細胞組技術(shù)人員畢業(yè)于東南大學(xué)、華中科技大學(xué)等高校生物學(xué)相關(guān)專業(yè)，具有碩士研究生以上學(xué)歷，熟練掌握細胞學(xué)相關(guān)實驗，可開展多種細胞實驗。在同一批培養(yǎng)的細胞中也可以發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。

解決方法：黑點對細胞生長狀態(tài)沒有明顯影響，細胞增殖后會自然消失，因此除了置換外，無需特殊處理。如果細胞可能被小的運動點污染，建議增加培養(yǎng)皿細胞密度，以提高細胞存活率。

目的

學(xué)習(xí)和掌握外源基因?qū)胝婧思毎闹饕椒ā|(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。了解外源基因進入的一般性方法，觀測外源蛋白的表達（綠色熒光蛋白），為染色準(zhǔn)備實驗材料。

實驗原理

上圖所示是脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的示意圖，它顯示了外源質(zhì)粒進入細胞的一般過程。

外源基因進入細胞主要有四種方法：法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法。法是在細胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質(zhì)粒進入；磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進入細胞；細胞沉淀用15mlMEF生長培養(yǎng)基重懸后進行細胞計數(shù)(--般8只14天的胎鼠可獲得2-3x107細胞)。病毒法是利用包裝了外源基因的病毒細胞的方法使得其進入細胞。但是由于法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴、難度較大；病毒法的前期準(zhǔn)備較復(fù)雜、而且可能對于細胞有較大影響；所以現(xiàn)在對于很多普通細胞系，一般的瞬時轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法。

利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細胞密度以及轉(zhuǎn)染的時間長短和培養(yǎng)基中的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問題，通過實驗摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對于效率的提高有巨大的作用。