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發布時間：2021-09-01 08:24
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ELISA試劑盒的操作方法——雙夾心法
1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將稀釋至蛋白質含量為1～10μg/ml。在每個聚乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃ 過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。
2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃ 孵育1小時。然后洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。
3. 加酶標：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標（經滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小時，洗滌。
4. 加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。
5. 終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“ ”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調零后測各孔OD值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
Elisa試劑盒——Elisa實驗常見問題及解決方案
顯色淡，靈敏度偏低
1 試劑盒未充分平衡 試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開盒蓋，于室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫（約25℃）
2 樣品不適合做ELISA檢測 樣品一般選擇培養上清、血漿。其他樣品形式可能不適合做ELISA檢測或者需要優化檢測的條件（例如稀釋液的成分）
3 酶標板在貯存或洗后拍干時過分干燥 防止板過于干燥
4 包被遭到破壞 操作溫和，移液槍不能碰到孔底
5 樣本和孵育條件不合適 按照說明書條件，建議孵育過程中全程振蕩孵育。
6 洗滌浸泡時間過長 按照說明書操作。勿人為增加浸泡時間；
7 偶聯HRP試劑污染 棄去試劑，重新配置
8 錯誤的稀釋偶聯HRP試劑 棄去試劑，重新配置
9 TMB底物孵育時間過短，因非人為因素影響，需要優化孵育時間 確定合適的孵育時間：人為判定-高濃度的標準品出現深藍色；S4-5有淡藍色；機器判定620 nm波長下測定OD值達到0.6-0.65
10 樣本濃度過高或存在基質效應 建議做不同稀釋倍數，確認樣本稀釋倍數。
11 濾光片設置有問題或者波長選擇不對 確認儀器設置及選擇正確的波長檢測。
12 酶標板不適合做ELISA 不能使用細胞培養板，建議使用ELISA高吸附力板子。
重復性不佳，高CV值
1 樣品不均一 加樣前充分混勻樣品，取樣確保移液位置一致；
2 包被板表面遭到破壞 洗板加樣時盡量小心，避免破壞板的包被表面
3 孔與孔之間的交叉污染 孵育后取下蓋子小心操作，避免孔與孔的污染；封板膜不能重復使用
4 加樣量不一致 樣品稀釋前應充分混勻，盡可能使用同一移液器并裝緊吸嘴
5 邊緣效應（外周孔顯色較中心孔深） 孵育時盡量100 rpm旋轉混勻
6 微量加樣不準確 保證微量加樣的準確性和均一性
7 不正確的洗滌 洗液準確配制；充分洗滌，靜置15秒，確定每一步的洗滌
