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核酸試劑盒

RPA技術主要依賴于三種酶：能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，反應溫度在37°C左右。

重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA復合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發(fā)生鏈交換反應形成并啟動DNA合成，對模板上的目標區(qū)域進行指數(shù)式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結合，防止進一步替換。在這個體系中，由兩個相對的引物起始一個合成事件。整個過程進行得非常快，一般可在十分鐘之內(nèi)獲得可檢出水平的擴增產(chǎn)物。RPA擴增的基礎體系(TwistAmp? Basic)含有DNA擴增所需的所有試劑，我們只要準備好引物和模板就行。擴增結果可以通過凝膠電泳進行終點檢測，產(chǎn)物純化后可用于下游研究。

在這個基礎體系中添入不同的酶和探針，就可以實現(xiàn)多樣化的RPA應用。舉例來說，TwistAmp basic代理，TwistAmp? exo結合了exo探針技術和核酸外切酶III，能實現(xiàn)數(shù)據(jù)的實時讀取，就像熒光定量PCR一樣。不過反應終點的擴增子總量有所減少，適合獲得強熒光信號進行動力學分析，不適合終點檢測(比如跑膠)。將exo探針技術、核酸外切酶III和逆轉錄酶結合起來，可以一步實現(xiàn)RNA模板的實時擴增。

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如何提高擴增曲線的可重復性?

優(yōu)化擴增曲線考慮以下因素: 對于低拷貝數(shù)模板，TwistAmp basic總代理，不穩(wěn)定擴增可能是因為達到檢測限或者是反應混勻程度不同（未混勻的反應擴增效率不佳）。另外，在低溫情況下存貯，重組酶和輔助蛋白在50%甘油情況下形成沉淀，TwistAmp basic，也是可能導致不穩(wěn)定擴增的原因。所以，20x反應mix在室溫下解凍并震蕩渦旋將使其成為液體，不影響其功能，并且有效提高擴增效率。不穩(wěn)定擴增也可能是因為master mix量不足，在加入體系前，TwistAmp basic公司，用戶必須保證震蕩后20x反應組分均一。

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數(shù)字PCR法和熒光PCR法的關鍵區(qū)別在于檢測結果的定量和相對定量差異。據(jù)了解，現(xiàn)階段數(shù)字PCR試劑和機器相價格加高（一臺儀器近百萬元），在SARS-CoV-2快速檢測中的優(yōu)勢并不大。

不過，由于具備自動化程度更好、耗時更短等技術優(yōu)勢，國內(nèi)多家掌握了數(shù)字PCR技術的核酸試劑研發(fā)企業(yè)正在嘗試開發(fā)適用于SARS-CoV-2檢測的相關試劑盒。

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