德陽(yáng)細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)報(bào)告電鏡檢測(cè)「英瀚斯」

平板克l隆形成實(shí)驗(yàn)基本步驟::

1、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，分別用0.25%胰 蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，并把細(xì)胞懸浮在10%胎牛的DMEM培養(yǎng)液中備用。

2、將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每組細(xì)胞分別以每皿50、100、200 個(gè)細(xì)胞的梯度密度分別接種含10mL 37預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使細(xì)胞分散均勻。置37團(tuán)5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3周。

3、經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細(xì)胞5mL固定15分鐘。然后去固定液，加適量GIMSA應(yīng)用染色液染10~30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

4、將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)，或在顯微鏡(低倍鏡)計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的數(shù)。后計(jì)算形成率。形成率= (數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)) x100%平板形成試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗(yàn)成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞一定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不能過(guò)大。平板形成試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。公司先后獲得“江蘇省民營(yíng)科技企業(yè)”、“江蘇省科技型中小企業(yè)”、“江蘇省專精特新中小企業(yè)”等榮譽(yù)資質(zhì)，連續(xù)多年被評(píng)為“東南大學(xué)國(guó)家大學(xué)科技園企業(yè)”。試驗(yàn)成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞- -定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不能過(guò)大。

BrdU染色原理

 BrdU (5-脫氧尿核苷)是胸腺的衍生物，常用于標(biāo)記中新合成的DNA,可代替胸腺選擇性整合到細(xì)胞中新合成的DNA中(細(xì)胞周期S期)。這種摻入可以穩(wěn)定存在，隨著DNA進(jìn)入子細(xì)胞中BrdU特異性可以用于檢測(cè)BrdU的摻入，從而判斷細(xì)胞的增殖能力。BrdU特異性可以用于檢測(cè)BrdU的摻入，從而判斷細(xì)胞的增殖能力。2、間接磁性細(xì)胞標(biāo)記(Indirectmagneticcelllabeling)(磁珠結(jié)合不需要的細(xì)胞,游離于磁場(chǎng)的細(xì)胞為所需細(xì)胞)間接磁性細(xì)胞標(biāo)記需要聯(lián)合使用單ke隆或者多ke隆抗ti和MACS間標(biāo)微珠。

注射或細(xì)胞培養(yǎng)后利用抗Brdu單，ICC染色，顯示增殖細(xì)胞。同時(shí)結(jié)合其它細(xì)胞標(biāo)記物，雙重染色，可判斷增殖細(xì)胞的種類，增殖速度，對(duì)研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)有重要意義。因組織細(xì)胞內(nèi)無(wú)內(nèi)源性Brdu存在，所以Brdu應(yīng)用較廣摻入雙鏈DNA內(nèi)的Brdu,以氫鏈與腺呤結(jié)合，不能直接與抗Brdu反應(yīng)，需經(jīng)解鏈?zhǔn)笲rdu暴露方能被染色。BrdU特異性可以用于檢測(cè)BrdU的摻入，從而判斷細(xì)胞的增殖能力。常用的解鏈方法為鹽酸加熱、蛋白酶處理等，使DNA雙鏈部分單鏈化，抗Brdu小鼠單與增殖細(xì)胞核內(nèi)的Brdu結(jié)合，再經(jīng)酶標(biāo)抗小鼠IgG孵育、



呈色，顯示進(jìn)入S期細(xì)胞的情況。

細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的污染及解決方法

支原體污染

支原體是隱蔽的污染物，不能通過(guò)過(guò)濾去除。顯微鏡下沒(méi)有任何可見(jiàn)的支原體污染跡象，比如細(xì)胞病變和濁度或 pH 值變化（即使在嚴(yán)重污染的培養(yǎng)基中），這樣就會(huì)導(dǎo)致我們產(chǎn)生錯(cuò)誤的安全感。而在牛中，支原體是常見(jiàn)的微生物之一。

解決方法：通常的過(guò)濾滅菌方法對(duì)支原體沒(méi)有影響。電鏡形態(tài)學(xué)觀察法是一種比較經(jīng)典、可靠的方法，被認(rèn)為是確定細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞一旦被支原體污染，特別是對(duì)重要的細(xì)胞系，必須去除支原體，一般的方法有、抗和抗與補(bǔ)體聯(lián)合。值得注意的是，支原體很突出的結(jié)構(gòu)特征是沒(méi)有細(xì)胞壁。因此，它對(duì)作用于細(xì)胞壁的生物合成（如 β-內(nèi)酰胺類、萬(wàn)古等）完全不敏感，并且通常對(duì)多粘菌素、利福平和類具有耐藥性。相反，四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類對(duì)支原體的抑制作用很強(qiáng)，而氨基糖苷類和氯的抑制作用較弱。

細(xì)胞凍存有哪些注意事項(xiàng)？

細(xì)胞培養(yǎng)的傳代及日常維持過(guò)程中，在培養(yǎng)器具、培養(yǎng)液及各種準(zhǔn)備工作方面都需大量的耗費(fèi)，而且細(xì)胞一旦離開(kāi)開(kāi)始原代培養(yǎng)，它的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化。(6)未消化完的軟gu小塊繼續(xù)用II型膠原酶如_上法消化，直至軟gu塊基本消失。因此及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存十分必要。細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;細(xì)胞儲(chǔ)存在液氮中，溫度達(dá)-196℃，理論上儲(chǔ)存時(shí)間是的。

細(xì)胞凍存的步驟：

配制含 10%DMSO 或甘油、10~20% 小牛的凍存培養(yǎng)液;

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，去除舊培養(yǎng)液，用 PBS 清洗。

去除 PBS，加入適量胰蛋白酶 (覆蓋培養(yǎng)皿表面) 把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來(lái);

離心 1000rpm，5min;

去除胰蛋白酶，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的終密度為 5×106/ml~1×107/ml;

將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管 1~1.5 ml;

在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間及操作者;

凍存:標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1~-2℃/ min;當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。6．加入辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的親合素（Avi-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱 2h ，然后放入-70℃冰箱中過(guò)夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。