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發布時間：2020-11-28 10:34
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低溫生物菌種知多少？
實驗室菌種的傳代保藏過程
1. 按菌種說明書要求復溶菌粉，轉種于適當的增菌培養基內（G1），復壯后轉接至平板上，并于適當溫度下培養適當時間，分離出單個純種菌落，此為第2代（G2）。
2. 菌種鑒定完成后，挑取純菌落制成濃菌懸液用于制備甘油冷凍管，同時挑取純菌落轉接斜面菌種作為工作用菌種。此時，保藏菌種為第2代，但工作用菌種則為第三代。
3. 將第2代菌種管冷凍保存，將工作用菌種于適當溫度下培養適當時間后可用于試驗。
4. 取一支冷凍保存的G2代菌種轉種于平板和斜面培養基上，平板上的菌種制成冷凍保藏管第三代（G3），斜面培養基經適當溫度下培養適當時間后用作工作用菌種（W3）。
5. 將第三代菌種（G3）冷凍或低溫保存，將生長、轉種后的G2菌種經滅菌處理后丟棄。
6. 當工作用菌種代數小于5時，可直接用上一代工作用菌種轉接下一代工作用菌種，如W3可直接轉接為W4。
7. 按上述程序操作，直至G4轉為W5為止，需重新開啟安瓿，再重復上述操作程序、保藏和使用菌種。
以上方法中，菌種被分為兩類。傳代用菌種和工作用菌種，傳代用菌種用于甘油冷凍管法保藏，工作用菌種用斜面低溫保藏法保藏。
實驗證明，甘油冷凍管的有效期至少為2年，但其主要適用于細菌（需氧）、酵母菌的傳代、保藏、真菌和芽孢類細菌則需應用其它方法。
低溫生物菌種的保存方法有哪些？
（一）培養基保存法
利用各種斜面和半固體培養基，加上石蠟油保存菌種，是一種簡易的保存方法。
1.普通瓊脂斜面保存法：腸道菌、等一般細菌可接種于不含糖的普通瓊脂斜面上，斜面底部應加少許無糖肉膏湯，以防干涸。經35℃培養18～24h后，移種于4℃冰箱中，一般可保存一個月，每月傳代一次。
2.血液瓊脂斜面保存法：鏈球菌、應接種于血液瓊脂斜面上，35℃培養生長后，置4℃冰箱中保存，鏈球菌須半個月至1個月移種一次，新分離菌株須2～4天移種一次，以后逐漸延長移種時間，在適應后可延至半個月移種一次。
3.巧克力色斜面保存法：宜保存菌，并在35℃孵箱中保存，一般每2天移種一次。
4.雞蛋斜面保存法：適于保存含有Vi抗原的沙門菌屬及其他含表面抗原的細菌，一般可保存一個月。
5.半固體穿刺保存法：將細菌接種于瓊脂半固體或瓊脂半固體內，經35℃培養18～24h，再以無菌方法加入滅菌的液體石蠟。高度約lcm，置4℃冰箱保存。保存時間可達3～6個月。
（二）干燥保存法
原理是將細菌體內的水分蒸發掉，使其處于休眠和代謝停滯狀態，從而達到長期保存菌種的目的醫|學教|育網搜集整理。菌種干燥后低溫保存，可保存數年至十幾年。
（三）冷凍干燥保存法
本法又稱冷凍真空干燥法。它綜合利用了各種有利于菌種保存的因素（低溫、干燥和缺氧等），是目前有效的菌種保存方法之一。用本法保存的菌種具有成活率高，變異性小等優點，保存期一般3～5年，有的可長達10年以上。
（四）脫脂牛奶保存法
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低溫生物菌種貯存的方式
1.冷凍真空干燥法。將已培養、生長豐富的菌體或孢子懸浮于滅菌的、卵白、脫脂奶制成菌懸液，將懸液以無菌操作分裝于滅菌的玻璃安瓿瓶中，每管約0.3-0.5毫升，然后用耐壓橡皮管與冷凍干燥裝置連接，安瓿瓶放在冷凍槽中于-30℃至-40℃迅速冷凍，并在冷凍狀態下抽空干燥，并在真空狀態下熔封安瓿，在-20℃保存，一般可保存十年以上，但成本較高。
2.液氮超低溫保藏法。首先將要保藏的菌種制成菌懸液備用；其次，準備安瓿瓶，每瓶加入0.8毫升冷凍保護劑10%（體積比）甘油蒸餾水溶液，塞棉塞滅菌（1公斤/平方厘米，5分鐘）。無菌檢查后，接入要保藏的菌種，火焰熔封瓶口，檢查是否漏氣，將封好口的安瓿瓶放在凍結器內，以每分鐘下降1℃的速度緩慢降溫，使保藏品逐步均勻地凍結，直至-35℃，以后凍結速度就不需控制，安瓿凍結后立即放入液氮罐內，在-150至-196℃保藏，該法只有少數科研院所使用。
低溫生物菌種純化方法
1、傾注平板法
首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取一定量的稀釋液與熔化好的保持在40~50°左右的營養瓊脂培養基充分混合，然后把這混合液傾注到無菌的培養皿中，待凝固之后，把這平板倒置在恒箱中培養。單一細胞經過多次增殖后形成一個菌落，取單個菌落制成懸液，重復上述步驟數次，便可得到純培養物 2、涂布平板法
首先把微生物懸液通過適當的稀釋，取一定量的稀釋液放在無菌的已經凝固的營養瓊脂平板上，然后用無菌的玻璃刀把稀釋液均勻地涂布在培養基表面上，經恒溫培養便可以得到單個菌落。3、平板劃線法
簡單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環取培養物少許在平板上進行劃線。劃線的方法很多，常見的比較容易出現單個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、四格法等。當接種環在培養基表面上往后移動時，接種環上的菌液逐漸稀釋，然后在所劃的線上分散著單個細胞，經培養，每一個細胞長成一個菌落。
2、富集培養法
富集培養法的方法和原理非常簡單。我們可以創造一些條件只讓所需的微生物生長，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進行競爭，在生長能力方面遠遠超過其他微生物。所創造的條件包括選擇合適的碳源、能源、溫度、光、pH、滲透壓和氫受體等。在相同的培養基和培養條件下，經過多次重復移種，然后富集的菌株很容易在固體培養基上長出單菌落。如果要分離一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應敏感宿主細胞群體中，使其大量生長。通過多次重復移種便可以得到純的寄生菌。
