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ELISA試劑盒的操作方法——雙夾心法

1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/ml。在每個聚乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃ 過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。

2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃ 孵育1小時。然后洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。

3.　加酶標(biāo)：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小時，洗滌。

4.　加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。

5.　終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.　結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“ ”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

ELISA試劑盒的安全性

1． 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。

2． 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

4． 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。

5． 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。

6． 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

7． 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

Elisa試劑盒——Elisa實驗常見問題及解決方案

不正常的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1  錯誤的方法重懸標(biāo)準(zhǔn)品  加入正確量的溶液重懸標(biāo)準(zhǔn)品，重懸充分

2  標(biāo)準(zhǔn)品稀釋錯誤  按照說明書要求稀釋標(biāo)準(zhǔn)品

3  標(biāo)準(zhǔn)品污染  使用一次性的滅菌吸頭， 標(biāo)準(zhǔn)品貯存于2-8 ℃

4  錯誤的倍比稀釋步驟  按照說明書倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品

5  波長選擇錯誤 TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用，而 前者比色波長為450nm，后者為492nm。雙波長比色分析優(yōu)于單波長。

6  標(biāo)準(zhǔn)品混用  不同批號試劑勿混用

7  試劑盒在運輸途中時間太長，溫度太高，標(biāo)準(zhǔn)品失活  盡量縮短運輸時間，夏季應(yīng)放冰塊降溫

8  ELISA未終止而直接檢測450nm和620nm TMB顯色需終止后檢測，否則會出現(xiàn)620nm比450nm讀數(shù)高的現(xiàn)象。（數(shù)值仍有梯度規(guī)律）

ELISA試劑盒主要實驗原理

·包被：抗原或者能以物理性吸附于固相載體表面，原因是蛋白質(zhì)和聚乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，吸附之后能保持抗原反應(yīng)等活性；

·標(biāo)記：抗原或者可通過共價鍵與酶連接成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其活性和酶的催化特點；

·顯色：酶結(jié)合物與相應(yīng)包被在固相載體的抗原或者結(jié)合后，也被固定在固相載體上，加入酶的底物之后可出現(xiàn)顯色反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)的顏色深淺可計算抗原或者的相對含量。