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反相分離柱C18的適用范圍

C18反相分離柱廣泛應用于天然產物的提取，藥1物合成研究與開發，生物制藥等領域。若樣品極性偏大， Rf值非常接近，則不能分離正相模式；終產物要求純度98%以上，采用正相模式達不到；樣品在正相條件下存在溶解問題——不妨考慮采用反相C18模式分離。由于其填料粘合技術的成熟和良好的分離能力，C18柱已成為日常接觸分離提純研究人員zui多的反相柱。

反相式C18反相分離柱的主要參數

分離柱C18有多種參數，大致可分為四個方面：相鍵(包括修飾、封端)、填充載體(硅膠純度、填充顆粒類型、粒徑、孔徑)、柱體本身(柱效、柱內徑、柱長)和隱藏參數(比表面積、碳含量等)。小編想選擇以下幾個大家容易忽略的

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反向作用機制：

反相萃取分離主要是利用固相萃取材料官能團與目標化合物碳氫鍵之間的非極性作用力。反相非極性的 SPE柱通常更適合從極性基質中提取分離出非極性和中等極性的目標化合物。

對利用非極性作用力吸附于非極性 SPE柱的目標化合物，可用氯1仿、環己1烷、乙1酸乙1酯等具有非極性的溶劑洗脫。當溶劑的洗脫強度足夠大，可以使目標化合物與吸附劑非極性基團間的范德華力不受影響時，使其在 SPE柱中順利洗脫。即使是極性更強的甲1醇，對許多化合物而言，也有足夠的非極性力量來洗脫它。有時候，單種溶劑無法完全洗脫疏水性的目標化合物，可以考慮使用二氯甲1烷：乙1酸乙1酯(1:1，體積比)。

在選擇固相萃取機理時，應根據目標化合物和干擾物的性質考慮采用哪種萃取機理，因為許多化合物同時具有多種功能基。例如：2-萘胺是一弱堿性化合物(pKa=4.16)，它在一定 pH條件下也可呈陽離子態，同時它又具有疏水性和親水性的非極性官能團。此時，應根據樣品基質的具體情況，選擇有利于從干擾物中分離目標化合物的萃取機理。當樣品基質中同時含有大量非極性干擾雜質時，應盡量避免采用非極性萃取機制，而應采用以 pKa以下兩個 pH單位或以 pH=2.16為限的陽離子交換機制。相反，如果樣品中同時含有大量干擾雜質陽離子，則應調整樣品 pH值至6.16 (比 pKa 2單位高)，采用非極性萃取機制更為有利。

骨架形狀，粒徑，孔徑

硅的基質形態一般可分為非晶態和球態。無定型C18材料具有較高的性能價格比，是初步提純的首1選。且C18具有較好的顆粒均一性、較高的柱效和分離性，但相對價格可能稍高，可作為精制的選擇。

現在市場上可供選擇的填料粒徑很多，中低壓備通常是為了增大上樣量，增加流速，減小壓力而選用大粒徑填料；由于可以達到較高的柱效，因此小粒徑填料更適合高1效液相或高壓制備。在選擇填料時還應充分考慮孔徑，分子量小于5000 da時選擇孔徑(80~120 da)，而對于蛋白質大分子分子量20000 da左右、分子量大于20000 da的樣品，通常不采用C18分離模式，采用 SEC等模式進行分離。

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用溶劑的次序也會影響流動速度，如活化溶劑是二氯甲1烷，平衡溶劑是水，因為二氯甲1烷與水不互溶，活化平衡時間的流動速度較慢。因此，我們建議在兩種非互溶溶劑之間加入過渡溶劑甲1醇，這樣就能解決這個問題。

氣層效應

氣層可以阻止液體流動，從而引起流速問題。氣層形成的主要原因是篩板或填料松動。商品產品通過運輸到用戶手中，在運輸過程中，填與篩板之間發生位移、松動，很容易形成氣層。這個氣氣層有時會更明顯，能看出填充物有斷裂或縫隙。有時候松動并不明顯，使用小柱體時才能感覺到流速的不同。這樣，通過壓實篩板或使用正負壓將空氣排出即可解決輕微松動問

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固相萃取柱能否重復使用？

回答：理論上說，可以洗干凈后再使重復使用，因為在沖洗過程中不能保證完全沖洗干凈，其殘留物質在下次使用可能會對被測物造成干擾，導致回收率和重現性差！

相同規格、不同品牌的固相萃取小柱樣做相同樣品為何回收率不同？

答：不同品牌的小柱雖然等效規格固定也一樣，但其填充源、接合技術、裝填工藝等因素都會造成樣品回收率的差異！

規范中規定某一品牌的固相萃取柱，是否可以用其它同一品牌的固相萃取柱代替？

回答：理論上都可以，但是有些時候所測定的基質和物質比較復雜，使用標準推薦的固相萃取小柱可能會獲得更好的回收率和重現性！

反相萃取分離主要是利用固相萃取材料官能團與目標化合物碳氫鍵之間的非極性作用力。反相非極性的 SPE柱通常更適合從極性基質中提取分離出非極性和中等極性的目標化合物。對利用非極性作用力吸附于非極性 SPE柱的目標化合物，可用氯i仿、環i己烷、乙i酸乙i酯等具有非極性的溶劑洗脫。當溶劑的洗脫強度足夠大，可以使目標化合物與吸附劑非極性基團間的范德華力不受影響時，使其在 SPE柱中順利洗脫。即使是極性更強的甲i醇，對許多化合物而言，也有足夠的非極性力量來洗脫它。有時候，單種溶劑無法完全洗脫疏水性的目標化合物，可以考慮使用二氯甲i烷：乙i酸乙i酯(1:1，體積比)。

對典型的硅膠基質鍵合反相柱體，在不使用緩沖液的情況下，建議采用下列清洗溶劑系列：甲i醇---乙晴---75%乙晴/25%異丙i醇---異丙i醇---二氯甲i烷---己烷；每種溶劑至少沖洗10個柱體，分析柱的洗滌流速為250 mm×4.6 mm。zui終以10柱體積異丙i醇過渡，然后返回到原始流動相(不含緩沖鹽)，zui后返回到初始流動相配置。如使用紫外檢測器，則應避免選擇在紫外區域有吸收作用的溶劑，否則需要使用大量的溶劑沖洗基線，以使基線穩定。四氫呋i喃也是常用的清潔溶劑。如懷疑柱子受到嚴重污染，也可用二甲亞砜(DMSO)或二甲i基胺與水按50:50的比例混合，用流速低于0.5 ml/min的水沖洗色譜柱。